響應(yīng)面法優(yōu)化西藏黃牛源產(chǎn)纖維素酶菌株發(fā)酵條件

張慶芳，王澤坤，姜 南，于 爽，遲乃玉*

（1.大連大學 生命科學與技術(shù)學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

地球分布著豐富的綠色資源，纖維素（cellulose）約占整個植物干質(zhì)量的50%，是植物細胞壁的主要組成，所以纖維素的生產(chǎn)在地球上分布廣泛[1-5]。纖維素酶（cellulase）是降解纖維素以產(chǎn)生葡萄糖的一組酶的總稱。它是一種協(xié)同多組分酶系統(tǒng)，是一種復(fù)合酶，主要由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成。

由于反芻動物主要食物來源為綠色植物，因此纖維素是反芻動物的主要能量來源。瘤胃作為反芻動物消化食道中最重要的部位，也是進行消化最重要的復(fù)胃，因此，瘤胃中的纖維素降解菌則是反芻動物對粗纖維進行消化的重要執(zhí)行者[6-9]。從動物瘤胃篩選產(chǎn)纖維素酶菌株優(yōu)點是菌株來自動物本源，因此，在之后的工業(yè)生產(chǎn)酶制劑和益生菌制劑更加適合動物本身，酶制劑特性更加符合動物胃腸道的消化過程，益生菌制劑更加容易在動物胃腸道定植。

響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）在多種發(fā)酵優(yōu)化方法里是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳發(fā)酵條件的統(tǒng)計方法，響應(yīng)面法由于用擬合面的方式來完成，且更加直觀和清晰。而且具有試驗次數(shù)少、周期短、效率精度高等優(yōu)點，因此，已被廣泛應(yīng)用于生化反應(yīng)，發(fā)酵過程優(yōu)化[10-12]。

因為西藏地區(qū)特殊的生態(tài)環(huán)境特點（海拔高、溫度低和含氧量低），使西藏黃牛耐寒、耐低氧能力突出，并且瘤胃中的各類微生物產(chǎn)纖維素酶的能力較高。由于其地理環(huán)境和生態(tài)環(huán)境的限制，西藏地區(qū)各類產(chǎn)業(yè)尤其農(nóng)牧業(yè)發(fā)展一直較為緩慢，而當?shù)亟?jīng)濟中農(nóng)牧業(yè)占很大比例。因此，如何促進西藏地區(qū)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展是為當務(wù)之急。本研究從西藏黃牛瘤胃中分離出一株纖維素酶高產(chǎn)菌類芽孢桿菌（Paenibacillus）菌株N30，通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計試驗優(yōu)化其發(fā)酵條件，首先基于Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計找出重要影響因子，進而通過Design Expert.V8.0.6軟件中響應(yīng)面Box-Behnken（BB）試驗設(shè)計對響應(yīng)過程變量進行數(shù)學建模及研究，進一步優(yōu)化響應(yīng)因子，確定最優(yōu)發(fā)酵條件，為提高纖維素酶的活力，從而為該纖維素酶更深入研究及中試生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

類芽孢桿菌（Paenibacillus）N30：從西藏娟姍純種繁育示范基地的4.5歲雌性黃牛瘤胃中篩選得到，保藏在遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 主要試劑

酵母粉、胰蛋白胨、羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）、牛肉膏、MgSO4·7H2O、瓊脂粉、氯化鈉、KH2PO4、（NH4）2SO4：生物工程（上海）股份有限公司。試驗所用化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，CMC-Na 10 g，KH2PO42 g，（NH4）2SO41 g ，MgSO4·7H2O 1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg，NaCl 3 g，MnSO4·H2O 5 mg，pH7.0，蒸餾水定容至1 000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，酵母膏1 g，CMC-Na 20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，（NH4）2SO42 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，MnSO4·H2O 5mg，NaCl 3g，蒸餾水定容至1000mL。

1.2 儀器與設(shè)備

HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；UV-2102C紫外可見分光光度計：尼柯儀器科技有限公司；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

在無菌環(huán)境中將斜面保藏的菌株N30接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min培養(yǎng)24 h作為種子液。

1.3.2 粗酶液的制備

將種子液按照2%（V/V）的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在37℃、160 r/min條件下進行培養(yǎng)，將發(fā)酵液在4℃、4000r/min離心15min，棄去沉淀，收集上清作為粗酶液。

1.3.3 酶活測定方法

（1）葡萄糖標準曲線的繪制：取7支試管，分別加入2.0mg/mL葡萄糖標準溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6 mL、0.8mL、1.0 mL、1.2 mL和蒸餾水2.0 mL、1.8 mL、1.6 mL、1.4 mL、1.2 mL、1.1 mL、0.8 mL，向各試管中加入DNS 2.0 mL后在100℃水浴中加熱2 min以顯色，加熱后即刻用流水迅速冷卻，并用蒸餾水補充至15 mL?；旌虾?，在波長540 nm處測定OD540nm值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

（2）纖維素酶活力的測定：制備A和B管并加入1.8 mL 1%羧甲基纖維素鈉（用pH 4.8、0.2 mol/L乙酸緩沖液配制）。使用A管作為測定管，添加0.2mL酶溶液，B管作為空管。將A和B管放于50℃恒溫水浴中60 min。結(jié)束后取出，快速加入2mL DNS溶液至管中，然后加入0.2 mL酶溶液至B管中，再水溶10 min，快速用流水冷卻，加入蒸餾水補充使用B管至零點。用分光光度計在波長540nm條件下測量OD540nm值。纖維素酶活力定義：1 min水解底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個活力單位（U）。

1.3.4 菌株N30產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

碳源、氮源優(yōu)化：分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入CMC-Na、麩皮、秸稈粉、葡萄糖及蔗糖作為碳源，添加量為2%；分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、（NH4）2SO4及尿素作為氮源，添加量為0.7%。在37℃、160 r/min條件下培養(yǎng)72 h，按照酶活測定方法測定酶活，考察碳源、氮源種類對菌株N30產(chǎn)纖維素酶的影響。每個處理做3個平行。

麩皮添加量為1.0%～3.0%（梯度為0.5%）、蛋白胨添加量為0.3%～0.7%（梯度為0.1%）、培養(yǎng)基初始pH值為5.0～9.0（梯度為1）、發(fā)酵溫度為31～43℃（梯度為3℃）、接種量為0.5%～2.5%（梯度為0.5%）、轉(zhuǎn)速為130～170 r/min（梯度為10 r/min）、裝液量為75～175 mL/250 mL（梯度為25 mL/250 mL）、種齡為16～48 h（梯度為8 h）、KH2PO4添加量為0.1%～0.5%（梯度為0.1%）。在37℃、160 r/min條件下培養(yǎng)72 h，按照酶活測定方法測定酶活。每個處理做3個平行。

1.3.5 Plackett-Burman設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取9個影響因子作為研究目標，以纖維素酶酶活（Y）為響應(yīng)值，進行Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計，PB試驗設(shè)計的因素與水平見表1。

表1 PB試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of PB experiments design

1.3.6 最陡爬坡試驗設(shè)計

通過Plackett-Burman試驗結(jié)果中各個顯著影響因素效應(yīng)的大小來設(shè)定步長及變化方向，尋找峰值，迅速接近最佳值區(qū)域。

1.3.7 中心組合試驗設(shè)計

通過最佳爬坡試驗結(jié)果，將酶活最高的一組數(shù)值作為中心組合試驗中心點，使用Minitab15軟件進行Box-Behnken試驗設(shè)計，運用響應(yīng)面分析法對產(chǎn)酶條件參數(shù)進行優(yōu)化分析。使用Minitab 15軟件分析得到最優(yōu)結(jié)果，最后對預(yù)測值進行驗證。每個處理做3個平行。Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株N30產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 碳源的確定

圖1 不同碳源對纖維素酶酶活的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on cellulase activity

由圖1可知，當麩皮為唯一碳源時，纖維素酶酶活最高達17.1 U/mL，秸稈粉次之。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳碳源為麩皮。

2.1.2 麩皮添加量的確定

圖2 麩皮添加量對纖維素酶酶活的影響Fig.2 Effects of bran addition on cellulase activity

由圖2可知，當麩皮添加量為1.0%～2.5%時纖維素酶酶活逐漸升高，在麩皮添加量為2.5%時最大，為19.6 U/mL，麩皮添加量＞2.5%之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳麩皮添加量為2.5%。

2.1.3 氮源的確定

圖3 不同氮源對纖維素酶酶活的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on cellulase activity

由圖3可知，當?shù)鞍纂俗鳛槲ㄒ坏磿r，纖維素酶酶活最大，為15.4 U/mL，牛肉膏、酵母粉次之，當硫酸銨、尿素為唯一氮源時，纖維素酶酶活較低，可見菌株主要利用有機氮源。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳氮源為蛋白胨。

2.1.4 蛋白胨添加量的確定

圖4 蛋白胨添加量對纖維素酶活的影響Fig.4 Effect of peptone addition on cellulase activity

由圖4可知，當?shù)鞍纂颂砑恿繛?.3%～0.5%時，酶活逐漸增大，酶活在添加量為0.5%時達到最大，為16.7 U/mL，當?shù)鞍纂颂砑恿浚?.5%之后，酶活逐漸降低。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳蛋白胨添加量為0.5%。

2.1.5 初始pH值的確定

圖5 培養(yǎng)基初始pH對纖維素酶活的影響Fig.5 Effect of initial pH of medium on cellulase activity

由圖5可知，當初始pH值為5.0～7.0時酶活逐漸增大，在pH值為7.0時酶活最大，為17.6 U/mL，當初始pH值＞7.0時酶活逐漸降低。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳初始pH值為7.0。

2.1.6 發(fā)酵溫度的確定

圖6 發(fā)酵溫度對纖維素酶酶活的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on cellulase activity

由圖6可知，當發(fā)酵溫度為31～37℃時，纖維素酶酶活隨發(fā)酵溫度增加逐漸增大，當發(fā)酵溫度為37℃時，纖維素酶酶活最大，為17.3U/mL，當發(fā)酵溫度＞37℃之后，纖維素酶酶活降低。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳發(fā)酵溫度為37℃。

2.1.7 接種量的確定

圖7 接種量對纖維素酶酶活的影響Fig.7 Effect of inoculum on cellulase activity

由圖7可知，當接種量為0.5%～1.5%時，纖維素酶酶活逐漸增大，當接種量為1.5%纖維素酶酶活最大，為16.3 U/mL，當接種量＞1.5%之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳接種量為1.5%。

2.1.8 轉(zhuǎn)速的確定

由圖8可知，當轉(zhuǎn)速為130～150 r/min時，纖維素酶酶活隨轉(zhuǎn)速的升高逐漸升高，當轉(zhuǎn)速為150 r/min時，纖維素酶酶活最大，為16.6 U/mL，當轉(zhuǎn)速＞150 r/min之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min。

圖8 轉(zhuǎn)速對纖維素酶酶活的影響Fig.8 Effect of rotational speed on cellulase activity

2.1.9 裝液量的確定

圖9 裝液量對纖維素酶酶活的影響Fig.9 Effect of liquid loading volume on cellulase activity

由圖9可知，當裝液量為（75～125）mL/250mL時，纖維素酶酶活逐漸增加，當裝液量為125 mL/250 mL時，纖維素酶酶活最大為16.4 U/mL，當裝液量＞125 mL/250 mL之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳裝液量為125mL/250mL。

2.1.10 種齡的確定

圖10 種齡對纖維素酶酶活的影響Fig.10 Effect of seed age on cellulase activity

由圖10可知，當種齡為16～32 h時，纖維素酶酶活逐漸增大，當種齡為32 h時，纖維素酶酶活最大，為15.6 U/mL，當種齡＞32h之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳種齡為32 h。

2.1.11 KH2PO4添加量的確定

圖11 KH2PO4添加量對纖維素酶酶活的影響Fig.11 Effect of KH2PO4 addition on cellulase activity

由圖11可知，當KH2PO4添加量為0.1%～0.2%時，纖維素酶酶活逐漸增加，當KH2PO4添加量為0.2%時，纖維素酶酶活最大，為17.1 U/mL，當KH2PO4添加量＞0.2%之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶最佳KH2PO4添加量為0.2%。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計篩選顯著因子[13-16]

在單因素試驗的前提上，設(shè)計Plackett-Burman（N=12）試驗，對影響纖維素酶發(fā)酵中9個因素的顯著性進行研究。試驗的設(shè)計及結(jié)果見表3，利用Minitab15軟件進行主效應(yīng)分析，結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman experiments

由表4可知，麩皮、發(fā)酵溫度、蛋白胨的P值分別為0.004、0.005、0.026，由于這3個因素的P值均＜0.05，所以這3個因素對試驗結(jié)果的影響均＞95%，達到顯著水平，在所選因素中對試驗結(jié)果影響最大，其中麩皮、發(fā)酵溫度具有正效應(yīng)，蛋白胨具有負效應(yīng)。因此，選麩皮添加量、發(fā)酵溫度、蛋白胨添加量進行最陡爬坡試驗。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計的各因素水平及顯著性分析Table 4 Factors,levels and significance analysis of Plackett-Burman experiments design

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗是為了確定顯著影響因素的取值逼近中心點以及提高纖維素酶的產(chǎn)量，麩皮添加量（X1）、蛋白胨添加量（X2）及發(fā)酵溫度（X3）這3個因素的變化方向和步長的試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。由表5可知，3個顯著影響因素的中心點在第2組試驗附近，因此，確定以第2組的數(shù)據(jù)作為響應(yīng)面試驗的中心點，即麩皮添加量（X1）、蛋白胨添加量（X2）及發(fā)酵溫度（X3）分別為2.50%，0.50%和37℃。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

利用上述Plackett-Burman試驗結(jié)果，在PB試驗和最陡爬坡試驗確定的3因素3水平的基礎(chǔ)上，以纖維素酶活（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

運用Minitab15軟件對表6試驗數(shù)據(jù)進行回歸模型方差分析，結(jié)果見表7。對各因素進行二次多項式回歸擬合后，得到回歸方程如下：

由表7可知，該回歸模型的影響達到極顯著水平（P＜0.01），其自變量X1、X2、X3、X32對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），二次項X12、X22對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項影響均不顯著（P＞0.05）。失擬項表示所用模型與試驗的擬合程度，該設(shè)計失擬項P值為0.110＞0.05不顯著，因而無失擬因素存在?；貧w方程的決定系數(shù)R2=0.960 8＞0.9，校正決定系數(shù)為0.931 7＞0.9，表明響應(yīng)值變化有93.17%來自所選變量，說明模型擬合度較好，該回歸方程可用于代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行初步分析和預(yù)測[17-20]。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

經(jīng)Minitab15分析獲得酶活預(yù)測值最大時對應(yīng)的發(fā)酵條件為麩皮添加量2.81%，蛋白胨添加量0.53%，發(fā)酵溫度38.67℃，預(yù)測最大酶活為46.7U/mL。為了便于實際操作，將發(fā)酵條件修改為麩皮添加量2.8%，蛋白胨添加量0.5%，發(fā)酵溫度38℃，驗證試驗做3次平行，平均酶活為42.5 U/mL，與理論值符合，證明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵條件有效可行。優(yōu)化后酶活是優(yōu)化前（12.1 U/mL）的3.5倍。

3 結(jié)論

本實驗對類芽孢桿菌N30產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化。在單因素試驗前提上，采用Plackett-Burman試驗得出麩皮添加量、蛋白胨添加量、發(fā)酵溫度是最重要的3個影響菌株N30產(chǎn)纖維素酶的因素，利用Box-Behnken模型對類芽孢桿菌N30發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)酶條件進行響應(yīng)面優(yōu)化，進行回歸模型方差分析后證明模型擬合度良好。單因素優(yōu)化結(jié)果為麩皮添加量2.5%、蛋白胨添加量0.5%、初始pH7.0、發(fā)酵溫度37℃、接種量1.5%、轉(zhuǎn)速150 r/min、裝液量125 mL/250 mL、種齡32 h、KH2PO40.2%。響應(yīng)面優(yōu)化后發(fā)酵條件為麩皮添加量2.8%，蛋白添加量胨0.5%，發(fā)酵溫度38℃。在此優(yōu)化條件下酶活為42.5 U/mL，是優(yōu)化前酶活（12.1U/mL）的3.5倍。

菌株N30來自于西藏黃牛瘤胃，與其他從西藏地區(qū)動物胃腸道中篩選得到的產(chǎn)纖維素酶菌株相比酶活較高[21-22]，并且與從其他來源菌株所產(chǎn)纖維素酶相比更加適應(yīng)當?shù)匦竽翗I(yè)，酶制劑特性更加符合動物胃腸道的消化過程，在之后用作生產(chǎn)酶制劑的潛力更大。因此，菌株N30的發(fā)酵條件優(yōu)化研究可為后續(xù)發(fā)酵放大至工業(yè)生產(chǎn)提供基礎(chǔ)與依據(jù)。