出芽短梗霉固態(tài)發(fā)酵啤酒糟制備阿魏酰低聚糖和膳食纖維工藝研究

卜雯麗，李鳳偉，王 杰，丁霄霄，商曰玲，余曉紅*

（1.江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051）

啤酒糟（brewer"s spent grain，BSG）俗稱麥糟，是由麥芽和大米、淀粉等經(jīng)過糊化、糖化后，所分離出來的不溶性殘渣物，約占啤酒生產(chǎn)過程中所產(chǎn)的總副產(chǎn)物的85%[1-2]，其主要成分是蛋白質(zhì)和膳食纖維，并含有0.4%左右的阿魏酸[3]，營養(yǎng)價值豐富。阿魏酸主要通過酯鍵、醚鍵與阿拉伯糖及阿拉伯木聚糖等物質(zhì)交聯(lián)。阿魏酰低聚糖（feruloyl oligosaccharides，F(xiàn)Os）是低聚糖中不同位置上的糖羥基與阿魏酸羧基酯化形成的一類化合物，因此，兼具阿魏酸和低聚糖這兩種物質(zhì)的生理功能，且阿魏酸酯低聚糖能溶于水，具有雙親媒性和非離子屬性，滲透性強，容易進入人體線粒體而發(fā)揮抗氧化作用[4]。眾所周知，膳食纖維（dietary f i ber，DF）在許多生理過程和疾病預防中扮演一個重要的角色，啤酒糟又是一個寶貴的膳食纖維資源[5]。但如今很多企業(yè)直接將啤酒糟用來飼養(yǎng)動物或排放入河，長期以來，不僅會使得動物對啤酒糟不易消化、吸收，還會使得生態(tài)環(huán)境變得更加惡劣，同時也造成了啤酒糟的大量浪費[6]。因此，如何合理有效的利用啤酒糟，已成為啤酒廠等工業(yè)所面臨的的重大難題。啤酒糟是微生物發(fā)酵的良好基質(zhì)，我國是一個啤酒生產(chǎn)大國，2016年底我國生產(chǎn)啤酒達4 506萬t，與此同時也產(chǎn)生了大量的啤酒糟。出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）又名出芽茁霉，為半知菌類短梗霉屬，是一類與酵母有密切關系的食安性真菌[7-8]。出芽短梗霉生長迅速，培養(yǎng)數(shù)日就可生長成熟。研究表明，其生長過程中可生成木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等[9-12]。其中半纖維素酶可水解原料的細胞壁多糖，生成FOs；淀粉酶和蛋白酶水解原料中的淀粉、蛋白質(zhì)為其生長提供營養(yǎng)，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)檎婢嗵呛途w纖維，增加可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）來源。同時，直接將產(chǎn)木聚糖酶的微生物應用于FOs制備中，使微生物發(fā)酵產(chǎn)酶過程與酶解木聚糖獲得FOs的過程合二為一，可省去酶制劑生產(chǎn)中的分離純化步驟及不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）的制備步驟，降低生產(chǎn)成本，提高FOs和DF的產(chǎn)率。因此，利用出芽短梗霉發(fā)酵制備FOs和DF具有廣闊的應用前景[13-14]。

本實驗以啤酒糟為原料，出芽短梗霉為發(fā)酵菌株，采用固態(tài)發(fā)酵制備具有生理功能的阿魏酰低聚糖和膳食纖維，通過單因素試驗和正交試驗，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配方。在此基礎上，對接種量、發(fā)酵時間和溫度進行單因素試驗，并利用響應面法優(yōu)化出芽短梗霉發(fā)酵啤酒糟的工藝條件，以期為啤酒加工副產(chǎn)物啤酒糟的廣泛應用提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和原料

出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans）：本實驗室保存；啤酒糟：鹽城啤酒中試實驗室提供。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖：上海中試化工總公司；磷酸氫二鉀：廣東汕頭市西隴化工廠；維生素B2（vitamin B2，VB2）：上海士峰生物科技有限公司；木聚糖：上海阿拉丁試劑有限公司；尿素、甘氨酸、四硼酸鈉、亞硫酸鈉（Na2SO3）：生工生物工程股份有限公司；瓊脂粉：國藥集團化學試劑有限公司。所有化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[15]：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000 mL。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：啤酒糟20 g，木聚糖5%，尿素3%，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.5%，VB20.01%，蒸餾水40mL，pH自然。

采用高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度為121℃，時間15～20min。

1.2 儀器與設備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司；80-1臺式離心機、BS-2F振蕩培養(yǎng)箱：金壇市杰瑞爾電器有限公司；FA1104電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UV752N紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；SW-CJ-1D無菌操作臺：江蘇通澤器械有限公司；DNP電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海金宏實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將啤酒糟放入烘箱中于60℃烘干，粉碎至啤酒糟的顆粒徑度大小為60目，裝袋，密封，備用。

將馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面培養(yǎng)基放入28℃恒溫培養(yǎng)箱觀察2 d，沒有雜菌則可以進行接種；在PDA斜面培養(yǎng)基上接種出芽短梗霉，于恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)7 d，待長滿斜面后，將菌種接入馬鈴薯葡萄糖液態(tài)培養(yǎng)基中，在28℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d進行活化培養(yǎng)，即為種子液。

按12%（V/V）的接種量取出芽短梗霉的種子液接入到裝有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，每種同樣條件下做3個平行試驗，置于28℃條件下培養(yǎng)4 d。

1.3.2 分析方法

（1）阿魏酰低聚糖含量的測定

在YUAN X等[16]的研究基礎上稍作調(diào)整，稱取干燥后的固態(tài)發(fā)酵樣品0.5 g，用10倍50 mmol/L的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液（pH5.0）在28℃、250 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)60 min。結(jié)束后，離心（4℃，10 000 r/min，15 min），取上清液0.1mL，與0.9mL的0.1mol/L硼砂-甘氨酸緩沖溶液（pH10.0）混合，分別在波長345 nm和375 nm處測定混合溶液的吸光度值。根據(jù)如下的數(shù)據(jù)可推算出FOs的濃度。

阿魏酸的摩爾吸光系數(shù)ε"345nm=19 662 L/（mol·cm），ε"375nm=7 630 L/（mol·cm）；

阿魏酰低聚糖的摩爾吸光系數(shù)ε345nm=23064L/（mol·cm），ε375nm=31 430 L/（mol·cm）

C=（ε"345nm×A375nm-ε"375nm×A345nm）×b/（ε"345nm×ε375nm-ε345nm×ε"375nm）

式中：C為阿魏酰低聚糖濃度，mol/L；b為比色皿厚度，cm；A345nm為波長345 nm處的吸光度值；A375nm為波長375 nm處的吸光度值。

（2）不溶性膳食纖維（IDF）測定[17-18]

發(fā)酵樣品于60℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，取發(fā)酵樣1.00g，置平底燒瓶中，加15 mL去離子水，90℃水浴30 min，淀粉酶、蛋白酶酶解后過濾，加75 mL中性洗滌劑溶液，再加0.05 g無水Na2SO3，電爐加熱，5～10 min內(nèi)煮沸，移至電熱板上，保持微沸1 h，用10 mL丙酮沖洗殘渣，于耐酸玻璃砂芯漏斗中抽濾至干，移至烘箱內(nèi)，110℃保持4 h，取出冷卻至室溫，稱質(zhì)量。

（3）可溶性膳食纖維（SDF）測定[19]

取測定不溶性膳食纖維時第1次過濾的濾液，加入4倍體積分數(shù)為95%的乙醇，于4℃放置8 h后，離心，收集沉淀，無水乙醇洗滌離心2次，再加丙酮洗滌離心1次，105℃烘至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

（4）總膳食纖維

總膳食纖維（total dietary fiber，TDF）：可溶性膳食纖維與不可溶性膳食纖維之和。

（5）可溶性膳食纖維含量

可溶性膳食纖維含量：可溶性膳食纖維占總膳食纖維的百分比（SDF/TDF×100%）。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化

考察木聚糖（3%、4%、5%、6%、7%）、尿素（1%、2%、3%、4%、5%）和磷酸二氫鉀（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）添加量對制備FOs和可溶性膳食纖維含量的影響，在單因素試驗結(jié)果的基礎上，設計L9（34）正交試驗優(yōu)化選出碳源、氮源和無機鹽的最適添加量。

1.3.4 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件[20]

利用最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基組分，考察接種量（4%、8%、12%、16%、20%）、發(fā)酵時間（2、4 d、6 d、8 d、10 d）和發(fā)酵溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）3個因素對FOs含量及可溶性膳食纖維含量的影響。以單因素試驗得到的結(jié)果為基礎，依據(jù)Box-Behnken試驗設計的原理，以FOs含量及可溶性膳食纖維含量為響應值，進行3因素3水平的試驗設計。用Design-Expert version 8.0.6軟件設計試驗因素水平及編號如表1所示，每組實驗重復3次。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化試驗

2.1.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗

考察木聚糖（3%、4%、5%、6%、7%）、尿素（1%、2%、3%、4%、5%）和磷酸二氫鉀（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）添加量對FOs和可溶性膳食纖維含量的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同培養(yǎng)基組分添加量對阿魏酰低聚糖含量及可溶性膳食纖維含量的影響Table 2 Effect of different medium compositions addition on feruloyl oligosaccharides content and soluble dietary fiber content

由表2可知，隨著木聚糖、尿素及KH2PO4這3種培養(yǎng)基組分添加量的增加，F(xiàn)Os含量及可溶性膳食纖維含量先增加后減??；當木聚糖、尿素及KH2PO4添加量分別為6%、4%和1.0%時，F(xiàn)Os含量及可溶性膳食纖維含量最高；當木聚糖＞6%、尿素＞4%、KH2PO4＞1.0%之后，F(xiàn)Os含量及可溶性膳食纖維含量開始呈下降趨勢。因此，本實驗選擇木聚糖添加量（5%、6%、7%）、尿素添加量（3%、4%、5%）、KH2PO4添加量（0.5%、1.0%、1.5%）作為進一步正交試驗的因素水平。

2.1.2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗

以上述單因素試驗結(jié)果為基礎，以木聚糖（A）、尿素（B）和KH2PO4（C）添加量為評價因素，以FOs含量及可溶性膳食纖維含量為評價指標，進行L9（34）正交試驗，正交試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

由表3可知，3種培養(yǎng)基組分對FOs含量影響的主次順序依次是：木聚糖＞尿素＞KH2PO4，對可溶性膳食纖維含量影響的主次順序依次為：尿素＞KH2PO4＞木聚糖。綜合分析，以k值選擇最優(yōu)培養(yǎng)基組分組合為A2B2C2，即木聚糖6%、尿素4%、KH2PO41.0%。在此最佳培養(yǎng)基組分條件下進行3次驗證試驗，F(xiàn)Os含量為31.15 μmol/L，可溶性膳食纖維含量為21.56%。由表4可知，木聚糖和尿素對FOs產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05），而KH2PO4對固態(tài)發(fā)酵啤酒糟產(chǎn)FOs影響不顯著（P＞0.05）；尿素對可溶性膳食纖維含量也有顯著影響（P＜0.05）。

表3 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for medium composition optimization

續(xù)表

表4 以阿魏酰低聚糖含量及可溶性膳食纖維含量為評價指標的正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results based on feruloyl oligosaccharides content and soluble dietary fiber content

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 接種量對FOs含量及可溶性膳食纖維含量的影響

在最佳培養(yǎng)基組分的基礎上，考察不同接種量對FOs含量及可溶性膳食纖維含量的影響，結(jié)果見表5。

表5 接種量對阿魏酰低聚糖含量及可溶性膳食纖維含量的影響Table 5 Effect of inoculum on feruloyl oligosaccharides content and soluble dietary fiber content

由表5可知，隨著接種量增加，發(fā)酵后啤酒糟基質(zhì)中FOs含量及可溶性膳食纖維含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，接種量為12%時，兩項指標均達到最大值，分別為30.71μmol/L和22.30%。接種量較小時，出芽短梗霉生長過程中的延滯期太長，在發(fā)酵周期內(nèi)菌種沒有充分生長。接種量較大時，會導致出芽短梗霉生長過快，大量消耗營養(yǎng)物質(zhì)，使得營養(yǎng)物質(zhì)不斷減少，而去利用FOs和膳食纖維供其生長。因此，接種量12%為宜。

2.2.2 發(fā)酵時間對FOs含量及可溶性膳食纖維含量的影響

考察不同發(fā)酵時間對FOs含量及可溶性膳食纖維含量的影響，結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵時間對阿魏酰低聚糖含量及可溶性膳食纖維含量的影響Table 6 Effect of fermentation time on feruloyl oligosaccharides content and soluble dietary fiber content

由表6可知，在2～4 d的發(fā)酵時間內(nèi)，F(xiàn)Os含量及可溶性膳食纖維含量均呈現(xiàn)增加趨勢，在第4天達到最大值，分別為30.71 μmol/L和22.30%，發(fā)酵時間＞4 d之后，F(xiàn)Os含量及可溶性膳食纖維含量不斷下降，這種結(jié)果可能是因為一開始隨著時間的增加，出芽短梗霉分泌的阿魏酸酯酶的含量增加，但是到達一定的時間之后，出芽短梗霉所利用的營養(yǎng)物質(zhì)不斷減少，轉(zhuǎn)而去利用FOs和膳食纖維供給其生長，進而會造成FOs含量及可溶性膳食纖維含量的下降。因此，發(fā)酵時間4 d為宜。

2.2.3 發(fā)酵溫度對FOs含量及可溶性膳食纖維含量的影響

表7 發(fā)酵溫度對阿魏酰低聚糖含量及可溶性膳食纖維含量的影響Table 7 Effect of fermentation temperature on feruloyl oligosaccharides content and soluble dietary fiber content

由表7可知，隨著發(fā)酵溫度從26～30℃逐漸升高，F(xiàn)Os含量及可溶性膳食纖維含量逐漸增加；當發(fā)酵溫度為30℃時，出芽短梗霉發(fā)酵啤酒糟得到的FOs含量及可溶性膳食纖維含量均達到最大值，分別為37.76μmol/L和23.16%；發(fā)酵溫度＞30℃之后，兩者含量減少。因此，發(fā)酵溫度30℃為宜。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計及結(jié)果

以單因素試驗得到的結(jié)果為基礎，運用Design-Expert version 8.0.6軟件，以FOs含量（Y1）及可溶性膳食纖維含量（Y2）為響應值，以接種量、發(fā)酵時間及發(fā)酵溫度為因變量，進行Box-Behnken 3因素3水平響應面試驗設計，對出芽短梗霉固態(tài)發(fā)酵啤酒糟制備FOs和膳食纖維的工藝條件進行優(yōu)化，結(jié)果見表8。

表8 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗設計及結(jié)果Table 8 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗

通過Design-Expert軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，計算回歸系數(shù)，可以得到FOs含量（Y1）對接種量（A）、發(fā)酵時間（B）和發(fā)酵溫度（C）的多項回歸方程：

可溶性膳食纖維含量（Y2）對接種量（A）、發(fā)酵時間（B）和發(fā)酵溫度（C）的多項回歸方程：

回歸模型方差分析見表9。由表9可知，回歸方程模型P＜0.0001，表明模型具有極顯著性；兩個失擬項P=0.0658＞0.05，P=0.403 2＞0.05，說明失擬項均不顯著，表明回歸模型是合適的，可以用來分析和預測固態(tài)發(fā)酵制備FOs和膳食纖維的發(fā)酵條件。一次項接種量、發(fā)酵時間對FOs的含量影響極顯著（P＜0.01），發(fā)酵溫度對FOs的含量影響顯著（P＜0.05），發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度對可溶性膳食纖維含量的影響顯著（P＜0.05）。接種量與發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度交互作用對FOs的含量影響極顯著（P＜0.01）。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of regression model

2.3.3 響應面優(yōu)化分析

固定其中的一個因素，利用軟件Design-Expert做另外兩個因素交互作用的曲面圖，確定接種量、發(fā)酵時間及發(fā)酵溫度對FOs含量及可溶性膳食纖維含量的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，3個因素都是隨著因素水平數(shù)值增大響應值增大，當響應值達到極值后，隨著因素水平的增大，響應值逐漸減小。分析可知，接種量和發(fā)酵溫度兩個因素交互作用對FOs含量的影響極顯著；發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間兩個因素交互作用對FOs含量影響極顯著；發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間兩個因素交互作用對可溶性膳食纖維含量的影響顯著。結(jié)果與表9方差分析結(jié)果一致。

圖1 接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的交互作用對阿魏酰低聚糖含量和可溶性膳食纖維含量影響的響應面和等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum,fermentation time and temperature on feruloyl oligosaccharides content and soluble dietary fiber content

由Design-Expert Version8.0.6軟件得出FOs和可溶性膳食纖維制備的最佳發(fā)酵工藝條件為：接種量為12.26%，發(fā)酵時間為4.12 d，發(fā)酵溫度為29.27℃。為了便于實際操作，將上述優(yōu)化發(fā)酵工藝條件修正為：接種量為12%，發(fā)酵時間為4 d，發(fā)酵溫度為29℃。在此優(yōu)化條件下進行3次驗證試驗，F(xiàn)Os含量為37.67 μmol/L，可溶性膳食纖維含量為23.76%。與模型預測的FOs含量37.76 μmol/L，可溶性膳食纖維含量23.16%基本一致，說明響應面法得到的FOs和可溶性膳食纖維發(fā)酵工藝條件是可行的。

3 結(jié)論

本試驗采用正交實驗法優(yōu)化了啤酒糟固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分的添加比例，然后在接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度3個單因素試驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化了啤酒糟固態(tài)發(fā)酵制備FOs和膳食纖維的發(fā)酵條件。正交試驗得出培養(yǎng)基組分添加比例分別為木聚糖6%、尿素4%和磷酸二氫鉀1%。通過單因素及響應面試驗得到出芽短梗霉發(fā)酵啤酒糟的最佳發(fā)酵條件為接種量12%、發(fā)酵時間4 d和發(fā)酵溫度29℃。在此優(yōu)化條件下，F(xiàn)Os的含量達到了37.67 μmol/L，可溶性膳食纖維含量高達23.76%。本研究結(jié)果為啤酒糟的高效利用提供了理論依據(jù)。