白酒大曲風味物質(zhì)研究進展

周晨曦，鄭福平*，李賀賀，吳繼紅，黃明泉，孫寶國

（1.北京工商大學 食品學院 北京市食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；2.北京工商大學 食品學院 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048）

白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一。2017年，國內(nèi)白酒累計完成銷售收入5 654.42億元，與上年同期相比增長了14.42%，釀酒總產(chǎn)量達到1 198.06萬kL，可謂是中國的國民酒。俗話說“水是酒的血，曲是酒的骨，糧是酒的肉”、“有美酒必備佳曲”。曲是釀酒所用的糖化發(fā)酵劑，其質(zhì)量決定了白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。按照制曲工藝，白酒酒曲可分為三類：大曲、小曲和麩曲[2]。大曲是以小麥為主要原料、經(jīng)粉碎后加水壓制、在人工控溫條件下培育而成的曲塊，含有多種菌類及酶類物質(zhì)，因其相對于小曲形狀較大，又稱為塊曲[2-3]。由于富含各類微生物，在制曲和釀造過程中，這些微生物的生長和繁殖產(chǎn)生了大量的代謝物，進一步賦予各種大曲酒獨特的風格與特色，這是其他酒曲所不能比擬的[4]，因此，我國的名優(yōu)酒大都采用大曲釀造。茅臺酒、瀘州老窖和汾酒作為3種最著名的典型白酒風味代表（醬香型、濃香型和清香型），均使用大曲作為糖化發(fā)酵劑。

本文簡介了白酒大曲的制作工藝及分類，總結(jié)了大曲風味物質(zhì)研究現(xiàn)狀，包括前處理方法、定性定量方法和已檢出風味物質(zhì)的研究進展，為研究大曲風味物質(zhì)提供參考。

1 大曲的制作工藝與分類

大曲的培養(yǎng)具有生料制曲、自然網(wǎng)羅微生物、季節(jié)性強、堆積培養(yǎng)和培養(yǎng)周期長的特點[4]。因其香型、曲塊不同，制作工藝也有區(qū)別，但一般分為五步：選配原料、粉碎拌料、壓制成型、入室培養(yǎng)和貯曲保存[4-7]。

按照制曲過程中的最高品溫，大曲一般分為三類：高溫曲、中溫曲和低溫曲。高溫曲制曲時最高品溫高于60℃，一般用于生產(chǎn)醬香型白酒，以茅臺酒為代表，也有部分芝麻香型和兼香型白酒使用高溫曲；中溫曲制曲時最高品溫控制在50～60℃，一般用于釀造濃香型白酒，部分鳳香型、老白干香型和特香型白酒也采用中溫曲，但原料配比、制作工藝各有差異；低溫曲制曲時最高品溫低于50℃，一般用于釀制清香型白酒，以汾酒為典型。也有將不同大曲混合使用的，如景芝白干酒大曲以純小麥為原料，或小麥、大麥和豌豆混合制曲，將中溫曲（最高品溫50～55℃）與高溫曲（最高品溫高于65℃）混合使用；扳倒井酒大曲以小麥為原料，將高溫曲（最高品溫高于65℃）與多種微生物培養(yǎng)麩曲聯(lián)合使用[8]；馥郁香型酒鬼酒則將大曲與小曲結(jié)合使用，使用的大曲以純小麥為原料，制曲最高品溫達57～62℃。各名優(yōu)酒廠傳統(tǒng)制曲原料配比和最高品溫總結(jié)見表1。

表1 各名優(yōu)酒廠傳統(tǒng)制曲原料配比及最高品溫總結(jié)Table 1 Summary of the ratio of traditional Daqu-making materials and the maximum incubation temperatures of various famous Baijiu

2 大曲研究現(xiàn)狀

大曲中含有多種微生物菌系和各種釀酒酶系。從Web of Science數(shù)據(jù)庫中檢索有關“大曲”和“白酒”的研究論文，截止2018年11月總共發(fā)文量為246篇，出現(xiàn)頻率較高的詞如微生物和菌株均為微生物研究方面，即目前關于大曲的大部分研究主要集中在微生物群落結(jié)構(gòu)研究[10]和功能微生物研究上[11-12]。LIU J J等[13]研究發(fā)現(xiàn)，同種的水解酶與不同大曲中的代謝產(chǎn)物相關性不一致，如淀粉酶在清、濃香型大曲中與糖代謝物呈正相關，而在醬香型大曲中與糖代謝和蛋白質(zhì)代謝相關。

大曲除了是大曲酒釀造中的糖化發(fā)酵劑以外，也是生香劑。在制曲過程中，原料的分解產(chǎn)物和微生物的代謝產(chǎn)物，直接或間接地構(gòu)成了白酒的風味物質(zhì)。WANG W Y等[14]從茅臺大曲中分離出了一株枯草芽孢桿菌，并認為在經(jīng)過多輪微生物發(fā)酵后，通過美拉德反應將孢子的重要組分2,6-吡啶二羧酸（或其衍生物）轉(zhuǎn)化為各吡啶類化合物——茅臺酒的特征香物質(zhì)?？肺妒前拙浦械碾s味之一，尤其是清香型白酒中的主要雜味，而這一雜味的源頭為呈土味、霉味的土味素。DU H等[11，15]對不同成熟階段的大曲（老白干、汾酒）進行了研究，結(jié)果表明，土味素的主要來源可能是大曲中鏈霉菌代謝產(chǎn)生。

同時，大曲的質(zhì)量直接決定了基酒的質(zhì)量，對于大曲質(zhì)量的判斷、鑒別除了理化檢測外，感官鑒評也尤其重要。感官鑒評主要通過外觀和聞香判定，聞香即對大曲中的揮發(fā)性香氣成分所表現(xiàn)的綜合香氣進行感官評價[16]。因此，研究大曲中豐富的香氣成分不僅有助于研究白酒的香氣成分，還有助于對大曲質(zhì)量的判別。

有關大曲風味物質(zhì)的研究最早可追溯到2006年，趙東等[17]首次利用頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析了五糧液釀造用的一級、二級和三級大曲的揮發(fā)性成分，共對68種揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分進行了定性，發(fā)現(xiàn)大曲中的許多微量香氣成分如己酸、己酸乙酯和乙酸乙酯等與基礎酒中的香氣成分相似。范文來等[18]利用HS-SPME和GC-MS分析了某醬香型大曲中的揮發(fā)性成分，共檢測到112種揮發(fā)性成分，包括酸類、硫化物、呋喃類化合物、醛類、酯類、酮類、醇類、芳香族和吡嗪類等多種化合物，其中，含量最高的是酸類和吡嗪類化合物，單個化合物含量最高的是異戊酸。張春林等[19]利用HS-SPME和GC-MS分析檢測了瀘州老窖大曲中的揮發(fā)性成分，主要為醇類、吡嗪類、酯類、酮類和醛類，其中單個化合物的含量最高的化合物是2-戊醇。LE V D等[20]利用HS-SPME與GC-MS研究了汾酒大曲七個溫曲過程（臥曲、上霉、晾霉、潮火、大火、后火和養(yǎng)曲）中揮發(fā)性化合物的變化，共鑒定出83種主要揮發(fā)性化合物，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA），發(fā)現(xiàn)造成溫曲不同階段風味差異的化合物主要是己醛和（E）-2-辛烯醛等。胡沂淮等[21]利用索氏提取法結(jié)合GC-MS對洋河大曲進行了分析檢測，共檢測出39種揮發(fā)性成分，以有機酸類最多，其次是含氮化合物。發(fā)現(xiàn)大曲中所含有的揮發(fā)性成分主要是白酒中香氣成分的前體物質(zhì)。如異戊醇、1,2-丙二醇、正戊酸、正丁酸等既是風味前體物質(zhì)又是成品酒的風味物質(zhì)，四甲基吡嗪、乙醛縮二乙醇和丁內(nèi)酯等是成品酒的風味物質(zhì)，N,N-二甲基乙酰胺和1H-吡咯-2-甲醛等是風味前體物質(zhì)，這些物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵、蒸餾等工藝后消失。邢鋼等[22]應用HS-SPME結(jié)合GC-MS對瀘州老窖大曲制曲過程中揮發(fā)性成分進行了動態(tài)分析。共檢測到54種揮發(fā)性成分，其中醇類最多。動態(tài)分析結(jié)果表明，大部分揮發(fā)性成分（醇類、酯類、醛類、酮類、酸類、酚類和芳香族化合物）含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在8 d時達到最大值，隨后下降，到貯存后期含量趨于穩(wěn)定；大部分含氮化合物在發(fā)酵前期均沒有檢測到，發(fā)酵后期含量逐漸增加，隨著貯存時間增長含量又逐漸減少。陳美竹[16]利用HS-SPME和GC-MS分析檢測了3種醬香型高溫大曲（生產(chǎn)用曲、出倉黃曲和出倉白曲）的揮發(fā)性成分，共定性了40種化合物，包括12種雜環(huán)類化合物，其中以吡嗪類最多。孟維一等[23]利用HS-SPME和氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）研究了兩個芝麻香型酒廠生產(chǎn)的高、中、低溫大曲，共檢出69種揮發(fā)性化合物，棕櫚酸甲酯在所有大曲樣品中都有檢出，且含量都相對較高。嗅聞結(jié)果顯示，共有17種香氣活性化合物可被至少兩個嗅聞人員聞到，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪的香氣活性（odor activity value，OAV）值最高。李登勇等[24]以來源于不同生產(chǎn)地、企業(yè)和陳曲時間的醬香型大曲為研究對象，利用HS-SPME和GC-MS研究了其揮發(fā)性組分特征。共檢出113種揮發(fā)性化合物，其中50種物質(zhì)在所有樣品中均檢出，2,5-二甲基-3-丁基吡嗪、三甲基吡嗪和苯乙醇等11種揮發(fā)性物質(zhì)含量豐度較高。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，較高的吡嗪類物質(zhì)是茅臺原產(chǎn)曲的重要特征，而源于其他生產(chǎn)域的醬香型大曲中揮發(fā)性組分則以酯類為主。馬茹菲等[25]利用SPME-GC-MS研究了不同產(chǎn)地的清香型大曲，共檢出78種揮發(fā)性組分，其中醇類、酯類含量較高，揮發(fā)性成分豐富的樣品其感官評價也有較為濃郁的曲香。

3 大曲風味物質(zhì)的分析檢測方法

有關大曲風味物質(zhì)預處理方法和定性定量方法總結(jié)可見表2。

表2 有關大曲風味物質(zhì)研究預處理方法和定性定量方法總結(jié)Table 2 Summary of pretreatment methods,qualitative and quantitative methods of Daqu flavor compounds analysis

續(xù)表

3.1 大曲樣品前處理方法

大曲是固體狀態(tài)，提取香氣成分的難度比液體狀態(tài)的白酒更大。要從固體粉末中提取香氣成分，主要有兩種方法：①直接從樣品的頂空氣體中提取，如HS-SPME等；②將固體樣品轉(zhuǎn)換為液體樣品，再使用處理液體樣品的方法進行提取，如液液萃取-溶劑輔助風味蒸發(fā)（liquid-liquid extraction-solvent assisted flavor evaporation，LLE-SAFE）、同時蒸餾提?。╯imultaneous distillation-extraction，SDE）等。

3.1.1 固相微萃取法

大部分研究人員均采用HS-SPME來對大曲進行預處理。HS-SPME是集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品微萃取技術(shù)，操作簡單，攜帶方便，操作費用低，綠色環(huán)保。ZHENG J等[9]以不同溫曲階段的五糧液包包曲為研究對象，利用HS-SPME和GC-MS、氣相色譜-火焰離子化檢測器（gas chromatography flame ionization detector，GC-FID）研究了主要揮發(fā)性化合物，結(jié)果顯示，當溫度升高時，揮發(fā)物總含量也增加，在3 d達到最高水平，之后降低，且升溫階段是乙酸和乳酸的產(chǎn)生階段，降溫階段是吡嗪產(chǎn)生階段。3-甲基丁酸乙酯、（E,E）-2,4-己二烯醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛、乙酸和丁酸的OAV值較大。

然而，萃取頭的種類、樣品用量、萃取劑的選擇、萃取時間和萃取溫度等萃取條件都會影響SPME的萃取效果，針對以上影響因素，研究人員對萃取條件進行了優(yōu)化。范文來等[18]以某醬香型大曲為對象，研究了樣品萃取量、超聲波萃取時間以及不同萃取溶劑對萃取效果的影響。張春林等[19，35]以瀘州老窖大曲為對象，分別考察了萃取頭、萃取時間、萃取溫度、樣品用量及萃取方式對萃取效果的影響。郭兆陽等[41]以某清香型大曲為對象，對萃取頭、溶劑、樣品用量、萃取溫度、萃取時間和鹽離子濃度進行了優(yōu)化。陳美竹[16]以茅臺大曲為研究對象，考察了萃取方式、萃取溫度和萃取時間對萃取效果的影響。孟維一等[23]以芝麻香型白酒大曲為研究對象，對萃取頭、萃取時間、萃取溫度和樣品量進行了優(yōu)化，其優(yōu)化結(jié)果總結(jié)見表3。

表3 HS-SPME提取大曲風味物質(zhì)效果優(yōu)化總結(jié)Table 3 Summary of the extraction results optimization of Daqu flavor compounds by HS-SPME

3.1.2 溶劑萃取法

溶劑萃取法是風味分析中的經(jīng)典方法。其操作簡單，回收率高，但樣品使用量大，萃取液在濃縮過程中會損失一部分低沸點的揮發(fā)性成分，且有機溶劑毒性嚴重危害人體健康。同時，大曲中富含油脂、色素、蛋白質(zhì)以及糖類，這些不揮發(fā)性物質(zhì)嚴重影響氣相色譜對揮發(fā)性風味化合物的檢測。呂云懷等[39]通過浸提、液液萃取和GC-MS分析了濃、醬、清香三種大曲，共定性了103種揮發(fā)性化合物。醬香大曲的風味物質(zhì)最為復雜，離子豐度也最高，濃香大曲和清香大曲二者相差不是十分明顯。汪玲玲[34]則以5種不同香型的大曲（醬香、濃香、清香、豉香和藥香）和市售梁山大曲為研究對象，利用液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）處理樣品進行氣相色譜-嗅聞儀聯(lián)用（gas chromatographyolfactometry，GC-O）分析，HS-SPME和GC-MS對香氣物質(zhì)進行定性定量，結(jié)合聚類分析（cluster analysis，CA）和判別分析（discriminant analysis，DA）對樣品成功進行區(qū)分。

3.1.3 溶劑輔助風味蒸發(fā)法

溶劑輔助風味蒸發(fā)法（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）是一種從復雜食品基質(zhì)中全面、溫和地分離香氣化合物的方法，1999年由ENGEL W等[45]發(fā)明。SAFE系統(tǒng)是由蒸餾裝置和高真空泵的緊湊結(jié)合，樣品中的熱敏性揮發(fā)性成分損失少，萃取物具有樣品原有的自然風味。這是國際上較為流行的方法，目前已應用在黃酒酒曲[46]、黑麥面包[47]、可可粉[48]、脫脂奶粉[49]和谷物咖啡渣[50]等香氣物質(zhì)的提取上。ZHENG J等[9]利用LLE-SAFE和GC-O-MS研究了五糧液“包包曲”在溫曲過程中香氣成分的變化，共鑒定出54種香氣活性成分。

3.2 大曲風味物質(zhì)定性定量方法

目前廣泛應用于風味物質(zhì)定性分析的方法主要有標準品比對法、保留指數(shù)（retention index，RI）法、GC-MS和GC-O等。但大部分關于大曲風味物質(zhì)的研究，所采用方法均為MS分析進行譜庫對比，且只采用單一色譜柱進行分離，無法對所有化合物進行分離和準確定性，如共流出組分和具有相似質(zhì)譜圖的同分異構(gòu)體。在其他樣品的風味化學分析過程中，化合物的定性常采用多種方法相結(jié)合：首先采用MS進行譜庫對比初步定性、再通過計算組分在不同極性色譜柱上的保留指數(shù)與標準品的進行對比，同時結(jié)合聞香中的香氣特征等多種定性方式準確確定該化合物結(jié)構(gòu)[51]。

ZHANG C L等[52]利用HS-SPME和GC-MS分析研究了由瀘州老窖生產(chǎn)的高溫曲和中溫曲，實驗數(shù)據(jù)與Wiley譜庫和美國國家標準技術(shù)研究所（nationalinstituteof standardsand technology，NIST）譜庫相匹配，取當正反匹配度均＞800的鑒定結(jié)果；并計算化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）；部分利用標準化合物進行定性。共鑒定了75種揮發(fā)性化合物，其中含量最大的一組是含氮化合物，如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪，其次是醇類。

廣泛應用于食品風味物質(zhì)定量分析的方法主要有面積百分比定量法、峰高百分比法、歸一化法、外標定量法和內(nèi)標定量法等。如表2所示，目前關于大曲的定量分析大部分使用的還是單一內(nèi)標進行半定量，定量結(jié)果不夠準確，數(shù)據(jù)缺乏說服力。近年來，也有采用多種內(nèi)標對標準曲線進行校正來定量的。ZHENG J等[9]利用內(nèi)標標準曲線法對五糧液包包曲中的50種風味成分進行了定量分析，同時，采用芐酯衍生化法[53]定量了乙酸、丙酸、丁酸和乳酸四種有機酸。

4 大曲中已檢測到的風味物質(zhì)

據(jù)筆者統(tǒng)計，截至2018年12月，在大曲中已檢測到456種風味物質(zhì)（見表4）。按照化合物類別進行分類，其中酯類最多，達到94種，其次為醇類（62種）、醛類（43種）、酸類（41種）、吡嗪類（36種）、酮類（34種）、脂肪烴（25種）、其他雜環(huán)類（25種）、呋喃類（18種）、含氮類（16種）、酚類（14種）、醚類（11種）、含硫類（10種）、芳香烴（9種）、萜烯類（8種）、內(nèi)酯類（7種）和縮羰基類（3種）。466種風味物質(zhì)中定量了336種，其中250種只采用內(nèi)標法或歸一化法進行定量。從大曲類型來看，高溫曲中已檢測到255種風味物質(zhì)，其中定量分析了225種；中溫曲中已定性分析了328種風味物質(zhì)，其中定量分析了237種；低溫曲中已檢測到140種風味物質(zhì)，其中120種已被定量分析。

表4 大曲中已檢測到的風味物質(zhì)總結(jié)Table 4 Summary of Daqu flavor compounds detected in Daqu

續(xù)表

5 展望

曲香是酒香的重要香氣來源，相比于白酒風味成分研究上取得的巨大進展，有關酒曲的研究多還僅僅停留在微生物分析上，對酒曲風味成分的研究仍在初步階段。目前大部分研究都只通過MS譜庫檢索進行化合物定性、內(nèi)標法進行半定量分析，定性、定量方法不夠準確，尤其是部分非揮發(fā)風味物質(zhì)的存在可靠性存疑，很多風味物質(zhì)的位置異構(gòu)體、順反異構(gòu)體和光學異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)仍需進一步確認。另外，缺少對風味物質(zhì)香氣活性的研究，哪些物質(zhì)對曲香具有重要貢獻尚不清楚；如脂肪族烴、芳香烴等通常氣味較弱，對大曲風味貢獻不大。各個廠家、不同陳曲時間生產(chǎn)的大曲有何區(qū)別，哪些物質(zhì)導致了這些差異，目前尚未被科學、系統(tǒng)地認知。建議在今后研究中，借鑒分子感官科學研究方法，用GC-O分析白酒大曲揮發(fā)性成分，結(jié)合芳香萃取物稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）等方法確定大曲中主要香氣活性成分；采用雙柱保留指數(shù)比對、標準品對比等手段進行準確定性；采用外標標準曲線法、內(nèi)標標準曲線法或穩(wěn)定同位素稀釋法（stable isotope dilution assay，SIDA）等方法進行風味物質(zhì)準確定量。這將有利于深入了解大曲風味的組成及其對白酒香氣的貢獻，為提高大曲質(zhì)量、改善成酒品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支撐。