鐵線蓮屬植物ISSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化及遺傳多樣性分析

余偉軍， 姚 紅， 孫瑞琦， 王桂青， 鐘淮欽， 黃敏玲，①， 曾黎輝，①

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院， 福建 福州 350002； 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所， 福建 福州 350013)

鐵線蓮(ClematisfloridaThunb.)中觀花品種的觀賞性好、抗逆性強(qiáng)，是園林應(yīng)用中不可多得的藤本花卉。 鐵線蓮在日本以及歐洲許多國(guó)家的各類花園和家庭園藝中均有應(yīng)用[1]，深受人們喜愛(ài)。 鐵線蓮屬(ClematisLinn.)中部分種類具有清熱利尿和止痛祛風(fēng)等功效[2]，藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。 目前，越來(lái)越多的研究人員致力于鐵線蓮屬植物的開(kāi)發(fā)與利用，以獲得更大的市場(chǎng)效益。

全世界鐵線蓮屬植物有350 多種[3]，除南極洲外，在全世界范圍內(nèi)廣泛分布。 國(guó)內(nèi)該屬植物超過(guò)140 種，在全國(guó)各地均有分布，其中，在華中和西南地區(qū)的分布面積較大，并且，該屬植物在云南分布的種類最多，約有60 種以及20 變種[4]。

《中國(guó)植物志》[5]89-235將鐵線蓮屬植物劃分為8 組：尾葉鐵線蓮組〔Sect.Viorna(Reichb.) Prantl〕、長(zhǎng)瓣鐵線蓮組〔Sect.Atragene(Linn.) DC.〕、黃花鐵線蓮組〔Sect.Meclatis(Spach) Tamura〕、灌木鐵線蓮組(Sect.FruticellaTamura)、威靈仙組(Sect.ClematisTamurin)、鐵線蓮組(Sect.ViticellaDC.)、繡球藤組(Sect.CheiropsisDC.) 和絲鐵線蓮組( Sect.NaraveliopsisHand.-Mazz.)。 已有研究者對(duì)鐵線蓮屬植物的組織構(gòu)造、細(xì)胞學(xué)和形態(tài)特征等方面[6-10]進(jìn)行研究，為該屬植物的鑒定和分類奠定了基礎(chǔ)。 由于鐵線蓮屬植物分布廣泛，種類繁多，遺傳背景復(fù)雜多樣，僅通過(guò)花萼性狀和雄蕊被毛等生物學(xué)特征不能準(zhǔn)確地鑒定和分類，因此，應(yīng)在形態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)上結(jié)合分子生物學(xué)方法，對(duì)該屬植物進(jìn)行更全面的研究。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記使用的引物無(wú)需了解DNA 序列，且較RFLP、RAPD 和SSR 具有更高的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性[11-12]。 本研究利用ISSR 技術(shù)建立鐵線蓮ISSR-PCR 最佳反應(yīng)體系，對(duì)收集的國(guó)內(nèi)外32 個(gè)鐵線蓮屬植物(包括8 個(gè)野生種、1 個(gè)變種和23 個(gè)品種)以及2 個(gè)近緣屬植物〔包括鐵筷子品種‘水晶’ (Helleborusthibetanus‘Winterbells’) 和 耬 斗 菜 品 種 ‘ 喜 鵲 ’ (Aquilegia viridiflora‘Magpie’)〕進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，以期為鐵線蓮屬植物中種、變種和品種的分類提供科學(xué)依據(jù)，并為鐵線蓮屬植物種質(zhì)資源的利用和新品種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試34 份材料中，包括短柱鐵線蓮(Clematis cadmiaBuch.-Ham. ex Wall.)、 吳 興 鐵 線 蓮(C.huchouensisTamura)、 灰 葉 鐵 線 蓮 〔C.canescens(Turcz.) W. T. Wang et M. C. Chang〕、貴州鐵線蓮(C.kweichowensisC. Pei)、毛蕊鐵線蓮(C.lasiandraMaxim.)、棉團(tuán)鐵線蓮(C.hexapetalaPall.)、曲柄鐵線蓮(C.repensFinet et Gagnep.)和厚葉鐵線蓮(C.

crassifoliaBenth.)8 個(gè)野生種，分別采自浙江省湖州市長(zhǎng)興縣、浙江省湖州市吳興區(qū)、四川省阿壩藏族羌族自治州馬爾康縣、湖北省十堰市竹溪縣、湖南省懷化市沅陵縣、北京市懷柔區(qū)喇叭溝門滿族鄉(xiāng)、四川省樂(lè)山市峨眉山和廣東省從化市呂田鎮(zhèn)；還包括大花小木通〔C.armandiivar.farquhariana(Rehder et E.H. Wilson) W. T. Wang〕 1 個(gè) 變 種， ‘ 靈 感 ’(‘Inspiration’)、‘如古’(‘Rooguchi’)、‘包查德伯爵夫人’ (‘Comtesse de Bouchaud’)、 ‘ 魔 法 噴 泉’(‘Magic Fountain’)、‘翠鳥(niǎo)’(‘Kingfisher’)、‘鉆石’(‘Diamantina’)、‘紅星’ (‘Red Star’)、‘皇帝’(‘Kaiser’)、‘杰出’(‘Superba’)、‘斯托爾韋克’(‘Stolwijk Gold’)、‘檸檬之夢(mèng)’(‘Lemon Dream’)、‘阿迪森’(‘Addisonii’)、‘帕斯卡’(‘Pascal’)、‘櫻桃 唇 ’ (‘ Cherry Lip ’)、 ‘ 蘋 果 花 ’ (‘ Apple Blossom’)、 ‘ 倒 影’ (‘Reflections’)、 ‘ 烏 托 邦’(‘Utopia’)、‘綠玉’(‘Alba Plena’)、‘鈴兒響叮當(dāng)’(‘Jingle Bells’)、‘雀斑’(‘Freckles’)、‘波蘭精神’(‘Polish Spirit’)、‘前衛(wèi)’(‘Avant Garde’)和‘開(kāi)心果’(‘Pistachio’)23 個(gè)鐵線蓮屬品種以及鐵筷子品種‘水晶’和耬斗菜品種‘喜鵲’2 個(gè)近緣屬植物，均購(gòu)自浙江虹越花卉股份有限公司。

ISSR 分子標(biāo)記使用的86 條通用引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。 10×ExTaqBuffer2+(MgPlus)、dNTPs 和TaKaRaExTaq酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用CTAB 法[13]提取基因組DNA，采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA，并用UV-9000S 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)測(cè)定基因組DNA 的濃度和質(zhì)量，于-18 ℃保存、備用。

1.2.2 ISSR-PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化 在25.0 μL ISSR-PCR 反應(yīng)體系中，包括TaKaRaExTaq酶0.2μL，10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus) 2.0 μL，模板DNA濃度分別為10、20、40、60、80 和100 ng·μL-1，引物濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 μmol·L-1，dNTPs 濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 和0.35 mmol·L-1。 在進(jìn)行其中某一因子或水平實(shí)驗(yàn)時(shí)，其他因子固定為模板DNA 濃度 40 ng·μL-1、引 物 濃 度0.4 μmol · L-1及dNTPs 濃 度0.20mmol·L-1。 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，50 ℃退火l min，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物于4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化均使用引物879。

1.2.3 ISSR 引物的篩選及退火溫度的確定 利用優(yōu)化的ISSR-PCR 反應(yīng)體系，以灰葉鐵線蓮和‘櫻桃唇’基因組DNA 為模板，對(duì)86 條ISSR 引物進(jìn)行篩選，選出擴(kuò)增結(jié)果重復(fù)性好、擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性高的引物。

設(shè)置45.7 ℃、47.7 ℃、50.4 ℃、51.8 ℃、54.0 ℃和55.4 ℃ 6 個(gè)退火溫度，確定所篩選引物的最佳退火溫度。

1.2.4 ISSR 擴(kuò)增 利用篩選出來(lái)的引物、最佳退火溫度以及優(yōu)化的ISSR-PCR 反應(yīng)體系對(duì)供試34 份材料的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。 擴(kuò)增產(chǎn)物在0.5×TAE電泳緩沖液中用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB 染色10 min，JS-2000 凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)掃描并保存電泳圖。

1.3 數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)ISSR-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物同一位置的條帶，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，利用EXCEL 2003 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。 利用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算各材料間的遺傳距離。

2 結(jié)果和分析

2.1 DNA 提取及檢測(cè)

部分鐵線蓮屬植物基因組DNA 的電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。 結(jié)果顯示：擴(kuò)增條帶明亮清晰。 各樣品的OD260/OD280比值在1.6 ～2.0 之間，說(shuō)明蛋白質(zhì)和多酚類等干擾物質(zhì)含量少。

圖1 鐵線蓮屬部分植物基因組DNA 的電泳檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis detection result of genomic DNA from some of Clematis Linn. plants

2.2 ISSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化

鐵線蓮屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖2。 結(jié)果顯示：當(dāng)模板DNA 濃度為40 ng·μL-1、引物濃度為0.4 μmol·L-1和dNTPs 濃度為0.15 mmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增條帶較多且清晰度最好。 最終確定ISSR-PCR 最佳反應(yīng)體系的總體積為25.0 μL，包括40 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL、0.4μmol·L-1引物1.0 μL、0.15 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL、10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus) 2.0 μL、TaKaRaExTaq酶0.2 μL 和ddH2O 18.8 μL。

圖2 鐵線蓮屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果Fig. 2 Optimization result of ISSR-PCR reaction system of genomic DNA from Clematis Linn. plants

2.3 ISSR 引物的篩選和擴(kuò)增結(jié)果

分別用灰葉鐵線蓮和‘櫻桃唇’的基因組DNA為模板，對(duì)86 條ISSR 引物進(jìn)行篩選，選出擴(kuò)增條帶多且清晰的引物13 條。 對(duì)篩選出的13 條引物分別設(shè)置6 個(gè)退火溫度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，確定各引物的最佳退火溫度(表1)。

表1 用于32 個(gè)鐵線蓮屬植物及2 個(gè)近緣屬植物基因組DNA ISSR-PCR 反應(yīng)的引物和退火溫度及擴(kuò)增結(jié)果Table 1 Primers and annealing temperature used for ISSR-PCR reaction of genomic DNA from 32 plants of Clematis Linn. and 2 plants of related genera and their amplification results

利用篩選出的13 條引物對(duì)32 個(gè)鐵線蓮屬植物及2 個(gè)近緣屬植物基因組DNA 進(jìn)行ISSR-PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果(表1)顯示：13 條引物共擴(kuò)增出172 個(gè)條帶(位點(diǎn))，平均每條引物擴(kuò)增出13.2 個(gè)位點(diǎn)，其中，多態(tài)性位點(diǎn)168 個(gè)，平均每條引物擴(kuò)增出12.9 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率為98.2%。 13條引物中，引物845 和892 擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)最多，均為18 個(gè)。 其中，引物886 對(duì)32 個(gè)鐵線蓮屬植物及2 個(gè)近緣屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR 擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 引物866 對(duì)32 個(gè)鐵線蓮屬植物及2 個(gè)近緣屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR 擴(kuò)增圖譜Fig. 3 ISSR-PCR amplification pattern of genomic DNA from 32 plants of Clematis Linn. and 2 plants of related genera using primer 886

2.4 遺傳多樣性分析

基于ISSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果的32 個(gè)鐵線蓮屬植物及2 個(gè)近緣屬植物的聚類圖見(jiàn)圖4。

由圖4 可以看出：32 個(gè)鐵線蓮屬植物及2 個(gè)近緣屬植物的遺傳距離在0.22～1.21 之間，其中，32 個(gè)鐵線蓮屬植物的遺傳距離在0.22 ～1.09 之間，鐵筷子品種‘水晶’和耬斗菜品種‘喜鵲’與32 個(gè)鐵線蓮屬植物的遺傳距離較遠(yuǎn)。 在遺傳距離1.02 處，將32 個(gè)鐵線蓮屬植物分為3 個(gè)大組，‘杰出’單獨(dú)聚為1 個(gè)大組，‘斯托爾韋克’和‘檸檬之夢(mèng)’聚為1 個(gè)大組，其余29 個(gè)鐵線蓮屬植物聚為第3 大組；在遺傳距離0.92 處，將第3 大組進(jìn)一步劃分為3 個(gè)亞組，第1 亞組包括‘阿迪森’、‘帕斯卡’和‘櫻桃唇’，第2 亞組包括短柱鐵線蓮、灰葉鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、曲柄鐵線蓮、‘鈴兒響叮當(dāng)’和‘雀斑’，第3 亞組包括吳興鐵線蓮等20 個(gè)鐵線蓮屬植物；在遺傳距離0.77 處，將第3 亞組又進(jìn)一步劃分為7 個(gè)小組，其中，吳興鐵線蓮和貴州鐵線蓮聚為1 個(gè)小組。

供試32 個(gè)鐵線蓮屬植物中，8 個(gè)野生種(短柱鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、灰葉鐵線蓮、曲柄鐵線蓮、吳興鐵線蓮、貴州鐵線蓮、棉團(tuán)鐵線蓮和厚葉鐵線蓮)、1 個(gè)變種(大花小木通)與23 個(gè)品種間親緣關(guān)系的分析結(jié)果顯示：短柱鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、灰葉鐵線蓮和曲柄鐵線蓮與‘鈴兒響叮當(dāng)’和‘雀斑’的親緣關(guān)系較近；吳興鐵線蓮、貴州鐵線蓮、棉團(tuán)鐵線蓮和大花小木通與‘蘋果花’的親緣關(guān)系較近；厚葉鐵線蓮與‘靈感’、‘如古’和‘包查德伯爵夫人’等品種的親緣關(guān)系較近。

圖4 基于ISSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果的32 個(gè)鐵線蓮屬植物及2 個(gè)近緣屬植物的聚類圖Fig. 4 Dendrogram of 32 plants of Clematis Linn. and 2 plants of related genera based on ISSR-PCR amplification result

3 討 論

本研究建立的鐵線蓮屬植物基因組DNA ISSRPCR 最佳反應(yīng)體系的總體積為25.0 μL，包括40 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL、0.4 μmol·L-1引物1.0μL、0.15 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL、10×ExTaqBuffer2+(MgPlus)2.0μL、TaKaRaExTaq酶0.2μL 和 ddH2O18.8μL。 篩選出的13 條引物對(duì)32 個(gè)鐵線蓮屬植物及2 個(gè)近緣屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果顯示：共擴(kuò)增出172 個(gè)條帶(位點(diǎn))，其中，多態(tài)性位點(diǎn)168 個(gè)，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率為98.2%，說(shuō)明ISSR 分子標(biāo)記可以應(yīng)用于鐵線蓮不同品種以及野生種間的鑒別，也為進(jìn)一步的雜交育種工作中親本選擇與雜交組合的制定提供依據(jù)。

《鐵線蓮栽培12 月計(jì)劃》[14]將鐵線蓮品種劃分為常綠組(包括常綠大洋組、常綠木通組和常綠卷須組)、華麗雜交組、葡葉組、大葉組、西藏組、蒙大拿組、全緣組、德克薩斯組、尾葉組、長(zhǎng)瓣組、早花大花組、晚花大花組、南歐組和佛羅里達(dá)組。 本研究對(duì)32個(gè)鐵線蓮屬植物的聚類結(jié)果與鐵線蓮的園藝分類結(jié)果較為一致，如第1 等級(jí)劃分出蒙大拿組(‘杰出’)和長(zhǎng)瓣組(‘金葉子’和‘檸檬之夢(mèng)’)與其他組間的差異；第2 等級(jí)劃分出德克薩斯組(‘阿迪森’、‘帕斯卡’和‘櫻桃唇’)與其他組之間的差異；第3 等級(jí)劃分出常綠組(‘蘋果花’)、全緣組(‘靈感’和‘如古’)和大花組(‘包查德伯爵夫人’、‘魔法噴泉’、‘翠鳥(niǎo)’、‘鉆石’、‘紅星’和‘皇帝’)與其他組間的差異，由此可見(jiàn)，ISSR 分子標(biāo)記不僅能夠區(qū)分鐵線蓮不同品種的分組，對(duì)于同一分組中親緣關(guān)系較近的類群也能檢測(cè)出較高的多態(tài)性[15]。

本研究首次從分子水平鑒定了鐵線蓮屬野生種與品種間的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示：短柱鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、灰葉鐵線蓮和曲柄鐵線蓮與常綠卷須組的親緣關(guān)系較近；吳興鐵線蓮、貴州鐵線蓮和棉團(tuán)鐵線蓮與常綠木通組的親緣關(guān)系較近；厚葉鐵線蓮與全緣組和早花大花組的親緣關(guān)系較近。 相關(guān)研究結(jié)果表明：短柱鐵線蓮和吳興鐵線蓮屬于鐵線蓮組[16]，毛蕊鐵線蓮、曲柄鐵線蓮和貴州鐵線蓮屬于尾葉鐵線蓮組[17]，灰葉鐵線蓮屬于灌木鐵線蓮組[18]，棉團(tuán)鐵線蓮屬于威靈仙組棉團(tuán)鐵線蓮亞組(Subsect.AngustifoliaTamura)[5]153-156，[19]，而本文的研究結(jié)果顯示短柱鐵線蓮和毛蕊鐵線蓮的親緣關(guān)系更近，吳興鐵線蓮和貴州鐵線蓮的親緣關(guān)系更近。 推測(cè)導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是由于生物學(xué)性狀容易受到環(huán)境等外界因子的影響，說(shuō)明傳統(tǒng)的生物學(xué)形態(tài)分類方法不能完全準(zhǔn)確鑒定鐵線蓮屬植物的親緣關(guān)系，建議結(jié)合分子標(biāo)記等生物學(xué)方法與形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果還顯示：‘魔法噴泉’與‘鉆石’并非市場(chǎng)上所說(shuō)的同物異名，而是2 個(gè)不同的園藝品種。此外，2 個(gè)近緣屬植物鐵筷子品種‘水晶’和耬斗菜品種‘喜鵲’與 ‘杰出’的遺傳距離較近，建議進(jìn)行授粉雜交，觀察這2 個(gè)品種是否能夠通過(guò)與鐵線蓮屬植物進(jìn)行屬間遠(yuǎn)緣雜交來(lái)改造鐵線蓮屬植物的基因組，獲得更多的優(yōu)良性狀。