亞低溫對番茄hta9hta11 雙突變體光合碳同化相關(guān)指標的影響

盧盼玲， 郭世榮， 楊學東， 馮 巖， 季維維， 張 輝， 田守波， 朱為民，①

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院， 江蘇 南京 210095； 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學院設施園藝研究所 上海市設施園藝技術(shù)重點實驗室， 上海 201403；3. 上海星輝種苗有限公司， 上海 201403)

表觀遺傳機制可調(diào)控植物對逆境脅迫的應答，組蛋白變體H2A.Z 為重要的表觀修飾因子，參與多種非生物脅迫[1-3]，并且，其基因家族成員較多[4-5]。hta9hta11雙突變體植株具有多效性表型，且H2A.Z基因家族其他成員的表達不能補償HTA9 和HTA11 蛋白功能缺失[6]。

番茄(LycopersiconesculentumMill.)為重要的設施蔬菜和常用的模式植物，對低溫敏感[7]。 亞低溫條件下番茄hta9hta11雙突變體生長明顯遲緩[8]。 為了探明亞低溫條件下番茄組蛋白變體H2A.Z 對光合碳同化表觀遺傳機制的作用，作者就亞低溫對番茄野生型和hta9hta11雙突變體光合碳同化相關(guān)指標的影響進行了研究，以期進一步探明番茄組蛋白變體H2A.Z 的功能，并為利用表觀遺傳修飾提高番茄對亞低溫的耐受能力進而提高番茄產(chǎn)量和品質(zhì)提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

以上海市農(nóng)業(yè)科學院設施園藝研究所上海市設施園藝技術(shù)重點實驗室保存的番茄品種‘1479’的野生型和hta9hta11雙突變體幼苗為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 亞低溫處理方法 選取3 葉1 心期長勢良好且基本一致的野生型和hta9hta11雙突變體幼苗，移入人工氣候箱中，培養(yǎng)1 d 后進行亞低溫處理。 設置對照組(晝溫和夜溫分別為25 ℃和20 ℃)和處理組(晝溫和夜溫分別為15 ℃和10 ℃)。 其他培養(yǎng)條件相同，光照時間14 h·d-1、光照強度500 μmol·m-2·s-1，空氣相對濕度70%。 栽培基質(zhì)為V(泥炭)∶V(蛭石)= 2 ∶1的混合基質(zhì)。 采用隨機區(qū)組排列，每組野生型和hta9hta11雙突變體幼苗各50 株，均3 個重復。 處理20 d 后取樣檢測各指標。

1.2.2 指標測定 在晴天9：00 至11：00，每組取3 株苗，用GFS-3000 便攜式高級光合作用-熒光測量系統(tǒng) (德國Walz公司)測定苗頂端向下第3 枚葉的凈光合速率，重復測定3 次。 測定時，開放氣路，光照強度800 μmol·m-2·s-1，CO2濃度500 μmol·mol-1，葉室溫度(25±2) ℃，空氣相對濕度60%～70%。

每組取9 株苗，采集頂端向下第2 和第3 枚葉，測定葉綠素含量[9]以及淀粉和蔗糖含量[10]，并測定果糖-1，6-二磷酸醛縮酶活性[11]以及核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶和果糖-1，6-二磷酸酯酶活性[12]。 每個指標重復測定3 次。

每組取9 株苗，采集頂端向下第2 和第3 枚葉，每3 株為1 組，視為1 個重復。 將葉剪碎后混合，稱取0.1 g，在液氮中研磨成粉，用RNA 提取試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕提取總RNA，用PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕合成cDNA 第1 條鏈，用TBTMGreenPremixDimerEraser 試劑盒〔寶生物工程(大連)有限 公司〕在AppliedBiosystemsQuantStudio5 實時熒光定量PCR儀(美國ABI 公司)上完成擴增反應，并采用2-ΔΔCt法[13]計算基因的相對表達量。 供試基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用EXCEL 2016 軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果和討論

亞低溫對番茄野生型和hta9hta11雙突變體光合碳同化相關(guān)指標的影響見表2。 由表2 可見：對照組(晝溫25 ℃和夜溫20 ℃)野生型和hta9hta11雙突變體的凈光合速率(Pn)，葉綠素(Chl)和蔗糖(Suc)含量，果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(FBA)、果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)和核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)活性以及PRK、RbcS、RbcL、FBPase和FBA基因的相對表達量無顯著差異；hta9hta11雙突變體的淀粉(Sta)含量和TK基因的相對表達量顯著(P＜0.05)低于野生型，而其GAPDH、SBPase和RCA基因的相對表達量顯著高于野生型。 處理組(晝溫15 ℃和夜溫10 ℃)，hta9hta11雙突變體的Chl 含量略低于野生型；其Pn 值，Suc 和Sta 含量，F(xiàn)BA和FBPase 活性以及TK、GAPDH、SBPase、PRK、RbcL、RCA、FBPase和FBA基因的相對表達量顯著低于野生型；而其Rubisco 活性和RbcS基因的相對表達量顯著高于野生型。

表1 用于擴增反應的各基因的引物序列Table 1 Primer sequences of each gene used for amplification reaction

由表2 還可見：就野生型而言，對照組和處理組間的Chl和Suc 含量、Rubisco 活性和TK基因的相對表達量無顯著差異；處理組的Pn 值、Sta 含量和RbcS基因的相對表達量顯著低于對照組，而其FBA 和FBPase 活性以及GAPDH、SBPase、PRK、RbcL、RCA、FBPase和FBA基因的相對表達量顯著高于對照組。 就hta9hta11雙突變體而言，對照組和處理組間的Chl 和Suc 含量、Rubisco 活性以及FBPase和FBA基因的相對表達量無顯著差異；處理組的Pn 值，Sta 含量，F(xiàn)BA 活性以及TK、GAPDH和RCA基因的相對表達量顯著低于對照組，而其FBPase 活性以及SBPase、PRK、RbcS和RbcL基因的相對表達量顯著高于對照組。

表2 亞低溫對番茄野生型(WT)和hta9hta11 雙突變體(hta9hta11)光合碳同化相關(guān)指標的影響(±SD)1)Table 2 Effect of mild hypothermia on photosynthetic carbon assimilation related indexes of wild type (WT) and hta9hta11 double mutant(hta9hta11) of Lycopersicon esculentum Mill. (±SD)1)

表2 亞低溫對番茄野生型(WT)和hta9hta11 雙突變體(hta9hta11)光合碳同化相關(guān)指標的影響(±SD)1)Table 2 Effect of mild hypothermia on photosynthetic carbon assimilation related indexes of wild type (WT) and hta9hta11 double mutant(hta9hta11) of Lycopersicon esculentum Mill. (±SD)1)

處理2)Treatment2)Pn/(μmol·m-2·s-1)C1/(mg·g-1)C2/(mg·g-1)C3/(mg·g-1)WT hta9hta11 WT hta9hta11 WT hta9hta11 WT hta9hta11 CK 11.53±1.20Aa 11.84±1.41Aa 2.44±0.13Aa 2.57±0.22Aa 63.85±4.74Aa 58.69±5.66Aa 115.67±11.99Aa 100.24±9.81Ab T 8.59±1.57Ba 6.64±1.01Bb 2.32±0.14Aa 2.22±0.12Aa 70.46±5.90Aa 54.38±3.96Ab 73.03±7.62Ba 61.68±4.45Bb處理2)Treatment2)A1/(nmol·min-1·g-1)A2/(nmol·min-1·g-1)A3/(nmol·min-1·g-1)RE1 WT hta9hta11 WT hta9hta11 WT hta9hta11 WT hta9hta11 CK 80.79±0.50Ba 81.18±4.57Aa 34.83±2.35Ba 33.67±1.90Ba 83.59±6.43Aa 107.17±9.82Aa 0.50±0.05Aa 0.36±0.01Ab T 90.91±6.50Aa 52.46±7.42Bb 63.18±4.69Aa 47.08±3.98Ab 92.16±9.82Ab 130.74±13.39Aa 0.51±0.11Aa 0.18±0.01Bb

續(xù)表2 Table 2 (Continued)

本研究中，處理組番茄野生型和hta9hta11雙突變體的Pn值顯著低于對照組，處理組hta9hta11雙突變體的Pn 值顯著低于野生型，說明hta9hta11雙突變體對亞低溫更敏感。 處理組hta9hta11雙突變體的Suc 和Sta 含量顯著低于野生型；處理組hta9hta11雙突變體的FBA 和FBPase 活性顯著低于野生型，而其Rubisco 活性顯著高于野生型，據(jù)此推測在亞低溫條件下番茄組蛋白變體H2A. Z 可能對光合碳同化關(guān)鍵酶活性有調(diào)節(jié)作用。 與對照組相比，hta9hta11雙突變體TK、GAPDH和RCA基因的相對表達量顯著下降，而SBPase、PRK、RbcS和RbcL基因的相對表達量卻顯著上升，說明在亞低溫條件下番茄組蛋白變體H2A. Z 可能參與調(diào)控光合碳同化關(guān)鍵酶基因的表達，但具體調(diào)控機制尚不明確，有待進一步研究。 綜合分析認為，亞低溫條件下番茄hta9hta11雙突變體的光合碳同化能力低于野生型，組蛋白變體H2A.Z 可能在調(diào)控番茄光合碳同化途徑中起重要作用。