食品微生物快速檢驗(yàn)和無(wú)菌操作技術(shù)

司福龍

摘 ? 要：在食品質(zhì)量檢驗(yàn)過(guò)程中，要根據(jù)實(shí)際情況合理選用阻抗法、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、ATP生物熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)等進(jìn)行食品微生物檢驗(yàn)。在檢驗(yàn)過(guò)程中，必須樹立無(wú)菌操作觀念，規(guī)范無(wú)菌操作程序，在取樣、樣品前處理、純種分離、革蘭氏染色等過(guò)程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)，順利完成食品微生物檢驗(yàn)工作，確保人群健康。

關(guān)鍵詞：微生物檢驗(yàn) ?食品檢驗(yàn) ?快速檢驗(yàn)技術(shù) ?無(wú)菌操作技術(shù)

中圖分類號(hào)：TS207 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：1674-098X（2019）02（a）-0125-02

食品微生物污染與人體健康息息相關(guān)，采用先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確、有效的檢驗(yàn)有利于維護(hù)人群健康。傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)以染色、培養(yǎng)和生化鑒定等為主，結(jié)果比較可靠，為食品微生物檢驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖需要消耗一定時(shí)間，應(yīng)及時(shí)檢測(cè);同時(shí)病原體培養(yǎng)還與營(yíng)養(yǎng)、抗生素使用和病原體含量等因素相關(guān)。隨著現(xiàn)代科學(xué)和物理化學(xué)、分子生物、免疫學(xué)等檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，快速微生物檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用。無(wú)菌操作是微生物檢驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，在食品微生物檢驗(yàn)時(shí)，檢驗(yàn)人員必須樹立無(wú)菌操作觀念，規(guī)范無(wú)菌操作程序，才能順利完成食品微生物檢驗(yàn)工作。

1 ?食品微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)

1.1 阻抗法

微生物在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖會(huì)引起電特性變化，阻抗法是利用電變化特性來(lái)間接測(cè)定食品中微生物含量的一種檢測(cè)技術(shù)，能夠檢測(cè)食品中絕大部分食品微生物。微生物能將培養(yǎng)基中的惰性大分子營(yíng)養(yǎng)素分解為具有微電活性小分子物質(zhì)，根據(jù)不同生長(zhǎng)期微生物濃度與培養(yǎng)基電阻性之間的線性關(guān)系，通過(guò)培養(yǎng)基電阻抗的檢測(cè)值可推算出食品樣本微生物的濃度。

1.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）

該技術(shù)的基本原理是通過(guò)體外酶促反應(yīng)高效合成特異性的雙鏈DNA片斷，之后通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物識(shí)別不同的細(xì)菌，由于在體外完成DNA片段擴(kuò)增，故又稱基因體外擴(kuò)增法。

PCR技術(shù)具有較高的靈敏度，且耗費(fèi)時(shí)間較短，理論上能檢出一個(gè)細(xì)菌的拷貝基因，通過(guò)PCR技術(shù)在短時(shí)間增菌甚或不增菌的情況下即可篩選檢測(cè)細(xì)菌。

PCR技術(shù)的缺點(diǎn)主要表現(xiàn)在：（1）出現(xiàn)假陰性結(jié)果。原因在于食物標(biāo)本、增菌培養(yǎng)基和其他微生物DNA可能抑制Taq酶活性;（2）出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。PCR操作過(guò)程嚴(yán)格，微量外源性DNA混入食品樣本可得到無(wú)限放大;（3）影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，由擴(kuò)增過(guò)程裝配誤差所致。

食品微生物檢測(cè)可應(yīng)用PCR全自動(dòng)檢測(cè)儀，這不僅可以克服手工操作的缺點(diǎn)，還能提高檢測(cè)結(jié)果的敏感性和特異性。

1.3 DNA芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景和空間。生物芯片是基于玻片和尼龍膜等載體，有序排列很多生物活性分子。這些分子在單位面積上密度較高，在一次試驗(yàn)下就能同時(shí)檢測(cè)多種食品樣本及其中的多種病原微生物。

根據(jù)芯片固定生物活性分子的不同，可分為蛋白芯片和基因芯片兩種類型，寡核苷酸探針或靶DNA為基因芯片的活性分子。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，DNA芯片具有少樣品需求、可快速準(zhǔn)確高效地顯示病原體遺傳信息，已被廣泛應(yīng)用在分析宰基因序列、快速診斷病原微生物感染、研究變異和耐藥機(jī)制、揭示發(fā)病機(jī)制以及感染性疾病的診斷和治療等。

1.4 ATP生物熒光技術(shù)

ATP是一種高能磷酸化合物，含量相對(duì)穩(wěn)定，普遍存在于各種細(xì)菌細(xì)胞中，并且是所有生物生命活動(dòng)的最終能量來(lái)源。ATP生物熒光技術(shù)的原理是在熒光素酶的催化作用下，通過(guò)ATP激活熒光素并與氧結(jié)合，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，釋放光量子。通過(guò)ATP不斷提供能量，不斷激活熒光分子，ATP濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。為降低外界干擾，增強(qiáng)特異性識(shí)別微生物能力，提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)效率，應(yīng)選取合適的ATP提取劑。

ATP生物熒光技術(shù)不需微生物培養(yǎng)，可在幾分鐘內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，普遍應(yīng)用于肉制品雜菌污染鑒定、飲料和調(diào)味品微生物檢測(cè)等。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

該技術(shù)是應(yīng)用最廣泛的酶免疫測(cè)定技術(shù)，其原理是在固相載體吸附抗原或抗體并行免疫酶染色，在酶作用下出現(xiàn)顯色反應(yīng)，之后運(yùn)用定性或定量方法分析有色產(chǎn)物量，進(jìn)而確定樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量，是一種特異性和敏感性較高的食品微生物檢測(cè)方法。

雙抗體夾心法、間接法、捕獲法、競(jìng)爭(zhēng)法是常用的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，可用于檢測(cè)食品中沙門氏菌、大腸桿菌、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌等微生物，檢測(cè)食品標(biāo)本數(shù)量可達(dá)上千份，具有成本低、反應(yīng)靈敏、適用范圍廣、定量和檢測(cè)速度快等優(yōu)勢(shì)。

2 ?食品微生物檢驗(yàn)的無(wú)菌操作技術(shù)

2.1 取樣

食品微生物檢驗(yàn)是無(wú)菌稱取要求檢驗(yàn)的樣本質(zhì)量，取樣過(guò)程中要使用消毒天平，剪刀、藥匙等檢驗(yàn)用品要經(jīng)170℃/2h干熱滅菌。取樣過(guò)程要嚴(yán)格按照無(wú)菌操作技術(shù)，切實(shí)保證樣品原始狀態(tài)。

2.2 樣品前處理

取樣后要行樣品前處理，整個(gè)過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)。一般稱取25g樣品于盛有225mL無(wú)菌稀釋液無(wú)菌均質(zhì)袋中均質(zhì)，制備成1：10樣品勻液進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)計(jì)數(shù)樣品要制備10倍系列稀釋樣品勻液，按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB4789.2-2016）要求完成樣品前處理操作。

2.3 純種分離

為準(zhǔn)確確定食品標(biāo)本微生物群體，檢驗(yàn)時(shí)要從混雜樣品中分離出疑似目標(biāo)菌，進(jìn)而得到純培養(yǎng)物。為促進(jìn)目標(biāo)微生物生長(zhǎng)繁殖，要根據(jù)微生物不同特性針對(duì)性選擇培養(yǎng)基并設(shè)定適宜培養(yǎng)條件;或通過(guò)應(yīng)用相應(yīng)抑制素，抑制除目標(biāo)菌以外的雜菌生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而淘汰其他雜菌，進(jìn)而將培養(yǎng)物接種在固體培養(yǎng)基上形成目標(biāo)菌的單菌落。按要求純化與鑒定單菌落，保證分離到純菌株。

在整個(gè)分離純化過(guò)程中，通常需要用接種環(huán)把微生物的純培養(yǎng)物從一個(gè)器皿轉(zhuǎn)接到另一個(gè)器皿中培養(yǎng)。如此時(shí)未嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)，很難保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，檢驗(yàn)人員應(yīng)加強(qiáng)自身實(shí)驗(yàn)水平與操作能力，確保無(wú)菌操作技術(shù)熟練準(zhǔn)確，不斷提高自身綜合能力。

2.4 革蘭氏染色

革蘭氏染色是食品微生物確認(rèn)鑒定的重要方法，將疑似目標(biāo)菌經(jīng)過(guò)純化分離后染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察微生物形態(tài)，能初步鑒定微生物是否為所檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌。涂片—初染—媒染—脫色—復(fù)染為革蘭氏染色的操作步驟，涂片是最重要最關(guān)鍵的步驟，涂片過(guò)程中必須嚴(yán)格無(wú)菌操作技術(shù)，避免混入雜菌，影響鏡檢結(jié)果。

2.5 空白對(duì)照

按照GB4789.2-2016要求，在有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)皿中加入1mL空白稀釋液作為空白對(duì)照，這是保證檢驗(yàn)結(jié)果真實(shí)有效的關(guān)鍵措施。

空白對(duì)照結(jié)果可直接反映檢驗(yàn)用品、無(wú)菌室空氣條件和操作人員是否符合無(wú)菌操作的要求，即檢驗(yàn)過(guò)程中所使用檢驗(yàn)用品是否已徹底滅菌、無(wú)菌室空氣條件是否滿足既定標(biāo)準(zhǔn)、操作人員是否規(guī)范完成無(wú)菌操作技術(shù)。只有空白對(duì)照結(jié)果符合要求，才能獲得可靠有效的檢驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，在食品質(zhì)量檢驗(yàn)過(guò)程中，要根據(jù)實(shí)際情況合理選用阻抗法、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、ATP生物熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)等進(jìn)行食品微生物檢驗(yàn)。在檢驗(yàn)過(guò)程中，必須樹立無(wú)菌操作觀念，規(guī)范無(wú)菌操作程序，在取樣、樣品前處理、純種分離、革蘭氏染色等過(guò)程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作技術(shù)，順利完成食品微生物檢驗(yàn)工作，確保人群健康。

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