天津地區(qū)幾種黃瓜真菌、細菌及病毒性病害研究

周瑩 常雪艷 杜爽 劉何 葛琳

摘 ? ?要：針對目前黃瓜各種真菌性病害、細菌性病害和病毒性病害高發(fā)的現狀，對天津地區(qū)黃瓜病害的發(fā)生情況進行田間觀察，并運用試紙條法、PCR法及RT-PCR法對黃瓜種子和葉片樣品進行檢測。結果表明：田間觀察發(fā)現，天津地區(qū)黃瓜病害主要有細菌性病害、真菌性病害及病毒性病害，其中真菌性病害最為普遍，褐斑病、白粉病、霜霉病多發(fā);試紙條法在30份黃瓜品種種子樣品中檢出種傳病害瓜類細菌性果斑病病原（Aac）1份，在11份葉片樣品中檢測出黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）和煙草花葉病毒（TMV）各1份;PCR法在30份種子樣品和2份疑似病害葉片樣品中有3份種子樣品檢出細菌性角斑病;RT-PCR法在30份種子樣品和6份疑似病害葉片樣品中有1份葉片同時檢出黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）和煙草花葉病毒（TMV）。

關鍵詞：天津;黃瓜;病害

中圖分類號：S436.421 ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.06.008

Abstract： In view of the current situation of various fungal diseases， bacterial diseases and viral diseases of cucumber， the experiment was conducted to investigate the occurrence of cucumber diseases in Tianjin through field observation， the seed and leaf samples of different cucumber varieties were detected by the method of dipstick methodology， PCR and RT-PCR. The results showed that according to the field observation， there were mainly bacterial diseases， fungal diseases and viral diseases occurred in cucumber in Tianjin， among which the fungal disease was the most common， especially brown spot disease， powdery mildew， downy mildew occurred frequently. Basing on the dipstick methodology， Acidovorax citrulli （Aac） was detected in 1 seed sample of 30 cucumber varieties， the Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） and Tobacco mosaic virus （TMV） were detected in 1 leaf sample of 11 cucumber leaf samples. Basing on the PCR results， the bacterial keratoderma was detected in 3 seed samples of 30 cucumber varieties but not detected in 2 leaf samples. The results of RT-PCR were showed that the Cucumber green mottled mosaic virus （CGMMV） and Tobacco mosaic virus （TMV） were detected in 1 leaf sample of 6 leaf samples but not detected in 30 seed samples.

Key words： Tianjin; cucumber; diseases

目前，隨著農業(yè)種植結構的調整，蔬菜產業(yè)已成為農業(yè)的重要支柱產業(yè)，是帶動農民增收的主要產業(yè)之一。在我國，蔬菜是除糧食作物外栽培面積最廣、經 濟地位最重要的作物，2016年我國蔬菜產量在80 005萬t，種植面積在2 166.9萬hm2左右，居農產品之首[1]。黃瓜是一種具有高經濟價值適于廣泛栽培的作物，以其果蔬兩用型的特點，成為設施栽培中最常見的品種之一，是我國保護地栽培的作物中第一大蔬菜作物[2]。黃瓜肉質脆嫩、汁多味甘，深受人們的喜愛，在我國蔬菜的周年供應中起著重要的作用。

天津地區(qū)黃瓜種植面積約為10 666.67 hm2，產量72萬t（2016年），在生產時多采用溫室栽培的方式，但由于特定的溫室環(huán)境、累年連作以及農藥的不科學使用，各種真菌性病害、細菌性病害和病毒性病害發(fā)生普遍，造成巨大經濟損失。天津地區(qū)黃瓜病害發(fā)生程度日趨嚴重，例如2016年和2017年，黃瓜褐斑病的棚發(fā)率在90%，而病毒病流行年份部分地區(qū)發(fā)病率可達100%[3]。

目前，黃瓜病害常見病害有十余種（表1）[4]，筆者利用病害檢測試紙條、PCR及RT-PCR等方法對38個黃瓜樣品進行了病害檢測，旨在了解天津地區(qū)黃瓜病害情況，為天津黃瓜農業(yè)生產中病害防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器設備

試驗品種（表2），均來自天津科潤農業(yè)科技股份有限公司，試驗儀器設備、試劑和耗材信息詳見表3。

1.2 方 法

試驗于2018年天津市薊州區(qū)玉米場和良種場兩地進行試驗調查。

育苗分大棚早春茬、秋延茬2個茬口。育苗采用穴盤育苗，穴盤規(guī)格為72孔;育苗基質為（草炭∶珍珠巖=10∶1）。種子在55 ℃的溫水中浸泡1 h，然后放在30 ℃恒溫箱中催芽，待到胚根露出種皮后播種，播種深度約1 cm。播種后覆蓋地膜，幼苗露出基質表面后及時揭除地膜，后按常規(guī)管理，苗期不進行肥料補給。每小區(qū)20株，株距為30 cm，行距30 cm，畦間隔90 cm，小區(qū)面積為3.6 m2。整個種植過程中水肥采用常規(guī)管理[5]。

1.2.1 田間觀察 ? ?通過觀察田間種植的黃瓜結合各病害的特點對黃瓜病害進行判別。

1.2.2 試紙條法 ? ?使用Agdia試紙條對30份黃瓜種子、11份疑似病害葉片進行檢測。黃瓜種子的檢測目標病原有：黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）、瓜類細菌性果斑病病原（Aac）;疑似病害葉片檢測病原有：煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）、瓜類細菌性果斑病病原（Aac）、疫霉屬鞭毛菌（PHYT）。具體方法參照試劑條使用說明。

1.2.3 PCR法 ? ?目標病原：細菌性角斑病病菌。細菌性角斑病病菌為種傳病害，對30個黃瓜種子樣品和2份疑似病害葉片進行檢測。使用植物組織DNA提取試劑盒提取DNA，并對DNA純度和濃度進行測定。引物序列為F：GTTCGGCGACGCAATCAATG，R：GTTGACTTCTTCGGCGGTGG;擴增片段大小為179 bp，引物合成工作由華大基因公司完成。按表4配制PCR反應體系進行PCR擴增，PCR擴增程序為：95 ℃預熱3 min;95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃ 5 s，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min[6]。PCR擴增完成后進行電泳檢測，對凝膠成像進行拍照分析。

1.2.4 RT-PCR法 ? ?目標病原：黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）。CGMMV為種傳病毒，對30份黃瓜種子樣品及6份疑似病毒病葉片進行檢測。同時對6份疑似花葉病害葉片進行CMV及TMV檢測。

使用TRIZOL提取總RNA，并測定RNA純度和濃度。引物序列見表5，根據表中序列進行引物的合成，合成工作由華大基因公司完成。按如下操作進行cDNA的合成：（1）PCR管中加入1 μL總RNA，1 μL引物，65 ℃溫浴7 min，冰浴5 min，瞬離;（2）再向PCR管中加入1 μL的RT ，4 μL的5×緩沖液，總反應體系為20 μL，其他用ddH2O補齊;（3）反應參數：37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃冷卻[7]。產物于-20 ℃冷凍保存。合成cDNA后，PCR過程參照1.2.3。PCR擴增完成后進行電泳檢測，對凝膠成像進行拍照分析。

2 結果與分析

2.1 田間觀察

通過田間觀察及病害判別，天津地區(qū)試驗用的30個黃瓜品種在生長過程中多發(fā)褐斑病、白粉病、霜霉病、灰霉?。▓D1）。

2.2 試紙條法

利用Agdia試紙條（圖2）對30份黃瓜種子樣品進行了種傳病毒病害黃瓜綠斑駁花葉病毒和瓜類細菌性果斑病病原的檢測，細菌性果斑病檢出1份，黃瓜綠斑駁花葉病毒未檢出;對溫室種植黃瓜出現病害的11份葉片樣品進行了煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）、瓜類細菌性果斑病病原（Aac）、疫霉屬鞭毛菌（PHYT）的檢測，檢出CGMMV和TMV各1份，其他均未檢出。

2.3 PCR法

通過PCR法對30份黃瓜種子樣品及2份田間疑似病害葉片進行檢測，如圖3中結果顯示：30份種子樣品及2份病害葉片中S3（津優(yōu)409）、S4（津優(yōu)601）、S7（津春4號）種子的檢測樣品中細菌性角斑病病菌檢測呈陽性。

2.3 RT-PCR法

通過RT-PCR法對30份黃瓜種子樣品及6份田間疑似花葉病害葉片進行檢測，如圖4、圖5中黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）凝膠電泳的檢測結果顯示：30份黃瓜種子樣品中黃瓜綠斑駁花葉病毒未檢出;6份疑似黃瓜綠斑駁花葉病毒病葉片中有1份（葉3）檢測結果呈陽性。

通過RT-PCR法對6份田間疑似花葉病害葉片進行檢測，如圖6中黃瓜花葉病毒（CMV）凝膠電泳的檢測結果顯示：6份疑似花葉病毒的葉片中，CMV未檢出，與試紙條法檢驗結果相同。

通過RT-PCR法對6份田間疑似花葉病害葉片進行檢測，如圖7中煙草花葉病毒（TMV）凝膠電泳的檢測結果顯示：6份疑似花葉病毒的葉片中，有1份葉子樣品（葉3）TMV呈陽性，與試紙條法檢驗結果相同。

3 結論與討論

目前，在我國黃瓜栽培中常見的病害主要為真菌病害，如白粉病、霜霉病、褐斑病[8-10]。近年來，褐斑病發(fā)病嚴重，個別地區(qū)棚發(fā)率100%[3]。筆者對天津地區(qū)黃瓜常見的病害進行調查，亦以這三種病害為主，但白粉病和霜霉病比褐斑病多發(fā)。對細菌性角斑病和細菌性果斑病進行了檢測，均有檢出，其中細菌性角斑病檢出3份種子樣品呈陽性，細菌性果斑病檢出1份種子樣品呈陽性，種子帶菌檢出率為13.3%。病毒病具有高致病性、傳播速度快、難以防治[11]，一旦蔓延，將會對黃瓜生產造成毀滅性的損失，在檢測中黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）、煙草花葉病毒（TMV）均有檢出。有研究表明，天津地區(qū)黃瓜主要毒原種類有黃瓜花葉病毒（CMV）、西瓜花葉病毒（WMV）、煙草花葉病毒（TMV）3種病毒，且存在病毒復合侵染[12]，本試驗中，黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）和煙草花葉病毒（TMV）同時在葉片3樣品被檢出，說明天津地區(qū)黃瓜病毒病害同樣存在復合侵染的情況。由于本試驗區(qū)域有限，采集樣本數不夠大，覆蓋品種也不夠豐富，所以無法完全檢出本地區(qū)黃瓜病害的所有病原，還需進一步開展檢測研究。

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