液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜鑒定賽拉嗪在人尿中的代謝產(chǎn)物

崔晶晶，孫英英，沈保華，劉萬卉，向 平

(1.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.司法鑒定科學(xué)研究院，上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；3.山東省威海市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，山東 威海 264200)

賽拉嗪(xylazine, C12H16N2S)是一種α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，它通過刺激中樞神經(jīng)α2-腎上腺素受體，減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)中去甲腎上腺素和多巴胺的釋放，導(dǎo)致鎮(zhèn)靜、肌肉松弛和對(duì)疼痛刺激的感知減少[1]，常作為動(dòng)物的鎮(zhèn)靜劑、止痛藥和肌肉松弛劑，又因其能產(chǎn)生麻醉效果，常被濫用導(dǎo)致中毒事故或犯罪的發(fā)生[2]。

藥物輔助犯罪(drug-facilitated crime, DFC)是指在中樞神經(jīng)抑制劑、興奮劑和致幻劑等精神活性物質(zhì)影響下，實(shí)施的麻醉?yè)尳?、性犯罪等不法行為。隨著網(wǎng)絡(luò)傳播和網(wǎng)購(gòu)的盛行，藥物輔助性犯罪(drug-facilitated sexual assault, DFSA)案件的數(shù)量及涉案藥物種類呈上升趨勢(shì)[7-8]。DFSA案件因所涉藥物攝入劑量小，代謝快等是法醫(yī)毒物鑒定的難點(diǎn)，而尿液中代謝產(chǎn)物檢測(cè)時(shí)限長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)在DFSA案件中發(fā)揮了重要作用[7]。賽拉嗪是近兩年常出現(xiàn)于DFSA案件中的藥物之一，但其在人體內(nèi)的代謝途徑以及主要代謝物的研究資料很少。

目前，代謝物確證研究多采用液相色譜-質(zhì)譜法[9-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]、高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[13-14]等。液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(LC-Q-Orbitrap MS)是基于Orbitrap靜電場(chǎng)軌道阱技術(shù)測(cè)定原理的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，具有高分辨率、高精密度、高靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍寬等特點(diǎn)，可同時(shí)獲得高質(zhì)量的多級(jí)質(zhì)譜圖(MSn)，保證分析結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[15]。Compound Discoverver軟件包含豐富的工具集，可以進(jìn)行預(yù)期化合物搜索及使用碎片離子搜索闡明(FIsh)結(jié)構(gòu)，將多個(gè)樣品數(shù)據(jù)信息合并到一份報(bào)告中，可對(duì)研究藥物的體內(nèi)代謝物提供技術(shù)支持。

本研究擬采用LC-Q-Orbitrap MS法及Compound Discoverver軟件對(duì)賽拉嗪陽(yáng)性尿液進(jìn)行篩查，并對(duì)其代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，探索賽拉嗪在人體內(nèi)的代謝方式及途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

UltiMate 3000 UHPLC 液相系統(tǒng)，ThermoScientificTMQ-ExactiveTM組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀(LC-Q-Orbitrap MS)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)及XcaliburTM3.1工作站；TDZ4-WS離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；XW-80A渦旋混合器：上海醫(yī)大儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；Minspin高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；超聲波清洗器：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司產(chǎn)品；乙酸乙酯：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲酸、乙酸銨：瑞士Fluka公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：超純水，經(jīng)Mili-Q系統(tǒng)制備；其他試劑均為分析純。

陽(yáng)性尿液來自一例DFSA案件，受害人尿液經(jīng)GC/MS分析檢出賽拉嗪成分。

1.3 樣品前處理

1.3.1液-液萃取法 取1.0 mL待測(cè)尿液于5 mL具塞試管中，加入2.0 mL乙酸乙酯提取溶劑，渦旋振蕩2 min后，以離心半徑 12 cm，3 000 r/min離心3 min。轉(zhuǎn)移有機(jī)層，取上層有機(jī)溶液，加入一滴NaOH(10%)溶液，重復(fù)上述步驟。合并上層有機(jī)溶液，于40 ℃空氣流下吹干，向殘留物中加入100 μL甲醇復(fù)溶后，待進(jìn)樣分析。

1.3.2蛋白沉淀法 取100 μL待測(cè)尿樣于1.5 mL離心管中，加入900 μL乙腈，渦旋振蕩2 min后離心3 min，上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣襯管，取5 μL進(jìn)樣分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 Thermo Scientific Hypersil GOLD PFP色譜柱(100 mm×2.1 mm×3 μm)，流動(dòng)相：A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min(98%A)，0.5～10 min(98%～2%A)，10～15 min(2%A)，15～20 min(98%A)；進(jìn)樣量5.0 μL；流速400 μL/min；柱溫26.7 ℃。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧電離正離子模式(ESI+)；噴霧電壓3.5 kV；殼氣、輔助加熱氣、碰撞氣：均使用高純氮?dú)?；探頭加熱器溫度300 ℃；毛細(xì)管溫度325 ℃；鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb。采用一級(jí)全掃描和自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)(full scan-ddMS2)的數(shù)據(jù)采集模式。

一級(jí)掃描分辨率70 000，二級(jí)掃描分辨率17 500，全質(zhì)量掃描范圍m/z70～1 050，可視寬度為0.7，碰撞能量為40、60、80 eV。進(jìn)樣前用校正液對(duì)質(zhì)譜的質(zhì)量軸進(jìn)行校正，質(zhì)量數(shù)偏差小于5×10-6。

利用XcaliburTM3.1工作站及Compound DiscovererTM3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 液-液萃取法

陽(yáng)性尿液經(jīng)液-液萃取法前處理后，由LC-Q-Orbitrap MS分析，其全掃描總離子流圖(TIC)示于圖1。賽拉嗪及各代謝產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1。賽拉嗪的保留時(shí)間為3.96 min，準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z221.110 58，其MS2譜圖中的碎片離子為m/z164.052 76、147.091 69、90.037 21。m/z90.037 21可作為噻嗪環(huán)的特征碎片離子。對(duì)于大多數(shù)代謝物，因其分子質(zhì)量太小而不能進(jìn)一步碎裂，得不到MS3譜圖，所以主要利用代謝物的MS和MS2譜圖進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。賽拉嗪及各代謝產(chǎn)物(M1～M5)的MS2譜圖示于圖2。通過Compound Discoverer 軟件分析得到5個(gè)可疑分子離子峰。準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z237.105 48，保留時(shí)間為3.37 min，比原準(zhǔn)分子離子大16 u，可能是增加了1個(gè)O為代謝產(chǎn)物M1。M1的[M+H]+離子在MS2譜圖中對(duì)應(yīng)的主要碎片離子為m/z163.086 55、180.047 76，比母離子的MS2碎片離子(m/z147.091 69、164.052 76)大16 u，而m/z90.037 21沒有發(fā)生改變，即噻嗪環(huán)沒有開裂，進(jìn)一步說明羥基化反應(yīng)發(fā)生在2，6-二甲基苯胺環(huán)上，但難以確認(rèn)羥基化的具體位點(diǎn)，故推測(cè)存在羥基化的兩個(gè)同分異構(gòu)體(M1-1、M1-2)。

圖1 樣品經(jīng)液-液萃取處理后的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of the sampleprepared by liquid-liquid extraction

表1 賽拉嗪在人尿液中代謝產(chǎn)物的LC-Q-Orbitrap MS數(shù)據(jù)(液-液萃取方法)Table 1 LC-Q-Orbitrap MS data of xylazine and its metabolites in human urine(liquid-liquid extraction)

注：a.賽拉嗪；b.M2；c.M1-1；d.M1-2；e.M3-1；f.M3-2；g.M4；h.M5圖2 賽拉嗪及各代謝產(chǎn)物MS2譜圖(液液萃取法)Fig.2 MS2 spectra of xylazine and its metabolites by liquid-liquid extraction

準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z235.089 77，保留時(shí)間為 3.46 min，比原準(zhǔn)分子離子大14 u(+16-2)，推測(cè)為賽拉嗪的氧化代謝產(chǎn)物M2。M2的[M+H]+離子在MS2譜圖中對(duì)應(yīng)的主要碎片離子為m/z181.079 51、164.052 98、136.075 82，未觀察到在m/z90.037 21 處噻嗪環(huán)的特征碎片離子，表明噻嗪環(huán)發(fā)生了氧化開環(huán)。

準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z251.084 72，保留時(shí)間為4.52 min，比原準(zhǔn)分子離子大30 u(16+16-2)，推測(cè)為賽拉嗪的氧化羥基化代謝產(chǎn)物M3。M3的[M+H]+離子在MS2譜圖中的主要碎片離子m/z104.016 44比對(duì)應(yīng)原體的碎片離子m/z90.037 21大了14 u(+16-2)，表明噻嗪環(huán)發(fā)生了氧化反應(yīng)。MS2譜圖中m/z197.074 25、148.075 64比M2的碎片離子m/z181.079 51、132.080 7大了16 u，表明在2，6-二甲基苯胺環(huán)處發(fā)生了羥基化反應(yīng)。由于難以確認(rèn)發(fā)生羥基化的具體位點(diǎn)，故推測(cè)存在氧代羥基化的兩個(gè)同分異構(gòu)體(M3-1、M3-2)。

準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z253.100 43，保留時(shí)間為3.42 min，比原準(zhǔn)分子離子大32 u(16+16)，表明存在發(fā)生二羥基化或S-氧化成砜反應(yīng)的代謝產(chǎn)物M4。MS2譜圖存在m/z147.091 67、164.052 83處的豐富碎片離子及2，6-二甲基苯胺環(huán)的特征碎片離子m/z181.079 41，排除2,6-二甲基苯胺環(huán)的羥基化反應(yīng)，推斷該反應(yīng)發(fā)生在噻嗪環(huán)上。因未發(fā)生水的消除反應(yīng)，排除了噻嗪環(huán)的二羥基化反應(yīng)，因此推測(cè)M4為賽拉嗪S-氧化成砜的代謝產(chǎn)物。

準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z181.079 91，保留時(shí)間為3.56 min，比原準(zhǔn)分子離子小40 u(—C3H4)，推測(cè)為賽拉嗪經(jīng)N,S-脫烷基化生成N-(2,6-二甲基苯基)硫脲，為代謝產(chǎn)物M5。在MS2譜圖中，可以觀察到m/z122.096 46處的豐富碎片離子，應(yīng)是賽拉嗪N-脫烷基化生成的代謝產(chǎn)物2,6-二甲基苯胺，m/z181.079 91可作為2,6-二甲基苯胺的前體離子存在，因其分子質(zhì)量較小，未能直接檢測(cè)出來。

2.2 蛋白沉淀法

由蛋白沉淀法前處理后的陽(yáng)性尿液經(jīng)LC-Q-Orbitrap MS進(jìn)樣后，出現(xiàn)多個(gè)色譜峰，其TIC色譜圖示于圖3。賽拉嗪的保留時(shí)間是4.10 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z221.110 60，其MS2譜圖中主要特征碎片離子為m/z164.052 76、147.091 67、90.037 19，示于圖4。通過Compound Discoverer 軟件分析，得到7個(gè)分子離子峰。賽拉嗪及各代謝產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表2，其中準(zhǔn)分子離子m/z237.105 45、253.100 27的主要碎片離子與液-液萃取法得到的代謝產(chǎn)物M1、M4一致，推斷其結(jié)構(gòu)相同。準(zhǔn)分子離子峰m/z165.102 28，保留時(shí)間為3.07 min，與賽拉嗪相差56 u(+O—C3H4S)，經(jīng)Compound Discoverer軟件分析為代謝產(chǎn)物M6，主要碎片離子為m/z148.075 82、122.096 44，推測(cè)其是由N-(2,6-二甲基苯基)硫脲分解得到的尿素結(jié)構(gòu)。

準(zhǔn)分子離子峰m/z413.135 74，保留時(shí)間為3.12 min，比原體增加了192 u，為代謝產(chǎn)物M7，與M1的準(zhǔn)分子離子相比相差176 u(+C6H8O7)，推測(cè)M7為M1與葡糖醛酸共軛得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

準(zhǔn)分子離子峰m/z317.061 04，保留時(shí)間為3.64 min，比賽拉嗪原體增加了96 u(+SO3)，為代謝產(chǎn)物M8，其主要碎片離子為m/z90.037 20，表明噻嗪環(huán)沒有改變，m/z237.105 47與M1的準(zhǔn)分子離子峰相同，故推斷M8(M8-1/M8-2)是由M1(M1-1/M1-2)與硫酸共軛得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

圖3 經(jīng)蛋白沉淀后的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatogram of the sampleprepared by protein precipitation

a.賽拉嗪；b.M1-1；c.M1-2；d.M4；e.M6圖4 賽拉嗪及代謝產(chǎn)物經(jīng)蛋白沉淀后得到的MS2譜圖Fig.4 MS2 spectra of xylazine and its metabolites by protein precipitation

化合物Compounds化學(xué)式Chemical formulas保留時(shí)間tR/min[M+H]+理論值Theoretical value(m/z)[M+H]+實(shí)測(cè)值Measured value(m/z)偏差Error/10-6賽拉嗪C12H16N2S4.10221.11070221.11060-0.47M1C12H16N2SO3.41237.10561237.10547-0.59M4C12H16N2SO23.49253.10052253.10027-0.99M6C9H12N2O3.07165.10224165.102280.24M7C18H24N2O7S3.12413.13770413.13574-4.74M8C12H16N2O4S23.64317.06242317.06104-4.35M9C18H24N2O6S3.92397.14278397.14108-4.28

準(zhǔn)分子離子峰m/z397.141 08，保留時(shí)間為3.92 min，比賽拉嗪原體增加了176 u(+C6H8O6)，為代謝產(chǎn)物M9，推測(cè)為賽拉嗪發(fā)生N-葡糖醛酸結(jié)合反應(yīng)得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

2.3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用液-液萃取法鑒定到賽拉嗪的7個(gè)代謝產(chǎn)物，M1-1、M1-2為羥基化產(chǎn)物，M2為氧化產(chǎn)物，M3-1、M3-2為氧代羥基化產(chǎn)物，M4為S-氧化產(chǎn)物，M5為N-(2,6-二甲基苯基)硫脲。經(jīng)M5的MS2譜圖推導(dǎo)所得的代謝產(chǎn)物2,6-二甲基苯胺與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10]。利用蛋白沉淀法鑒定到賽拉嗪的8個(gè)代謝產(chǎn)物，M1-1、M1-2為羥基化產(chǎn)物，M4、M6為S-氧化產(chǎn)物，M7、M8-1、M8-2、M9均為Ⅱ相代謝產(chǎn)物。蛋白沉淀的前處理方法能夠得到更多強(qiáng)極性的Ⅱ相代謝產(chǎn)物，而液-液萃取法更容易得到水溶性強(qiáng)的Ⅰ相代謝產(chǎn)物。兩種方法相互補(bǔ)充，能夠得到更充分的數(shù)據(jù)闡明藥物的體內(nèi)代謝途徑。

根據(jù)鑒定所得的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可以推斷賽拉嗪及其代謝產(chǎn)物之間的生物轉(zhuǎn)化途徑，示于圖5。轉(zhuǎn)化途徑與大鼠尿液[13]、大鼠肝微粒體[14]、馬尿[12]等的研究結(jié)果相似，主要的代謝物包括羥基化產(chǎn)物、氧化產(chǎn)物及S-氧化產(chǎn)物等。Lavoie等[14]在大鼠肝微粒體中檢測(cè)到的N-羥基化產(chǎn)物在人尿液中沒有檢測(cè)到，可能由物種不同或者濃度較低造成的。Meyer等[13]用標(biāo)準(zhǔn)尿液篩查方法(standard urine screening protocol)鑒定一例高加索人陽(yáng)性案例的結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，可以認(rèn)為不同人群賽拉嗪的體內(nèi)代謝途徑一致。經(jīng)研究，建議在生物檢材賽拉嗪分析時(shí)增加主要代謝物M1為目標(biāo)物，以增強(qiáng)可靠性，延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)限，提供更豐富的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)。含有硫脲結(jié)構(gòu)的藥物具有一定的毒性，賽拉嗪的代謝產(chǎn)物N-(2,6-二甲基苯基)硫脲的毒理學(xué)研究對(duì)于中毒后的監(jiān)測(cè)具有重要的臨床意義。

3 結(jié)論

本研究利用液-液萃取法和蛋白沉淀法對(duì)賽拉嗪陽(yáng)性尿液進(jìn)行前處理，通過LC-Q-Orbitrap MS進(jìn)行解析，共鑒定到13種代謝產(chǎn)物。賽拉嗪在人體內(nèi)發(fā)生羥基化、氧化、N-脫烷基化、S-氧化等Ⅰ相代謝反應(yīng)，羥基化代謝產(chǎn)物可與葡萄糖醛酸及硫酸結(jié)合發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng)。本研究初步闡明了賽拉嗪在人體內(nèi)的代謝途徑和主要代謝產(chǎn)物。

圖5 賽拉嗪在人體內(nèi)的代謝途徑Fig.5 Proposed metabolic pathways of xylazine in humans