痰熱清注射液輔助化療對Lewis肺癌模型小鼠免疫功能及血管內(nèi)皮生長因子、血管抑素、內(nèi)皮抑素水平的影響

任威 李娟

(湖北省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430079)

化療是治療肺癌的主要措施之一，然而化療藥品毒性強，甚至降低患者的免疫功能，因此，選擇一種療效顯著、安全性高的化療藥物尤為重要〔1，2〕。痰熱清注射液是一種中成藥，成分包括金銀花、黃芩及熊膽粉，對于各類感染性疾病有顯著治療效果〔3〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管抑素(AS)、內(nèi)皮抑素(ES)均為外周血管生成調(diào)節(jié)因子，主要通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖達(dá)到抗腫瘤目的〔4〕。本次研究進(jìn)一步分析痰熱清注射液輔助化療對Lewis肺癌模型小鼠免疫功能和VEGF、AS、ES水平的影響。

1 材料和方法

1.1材料 86只4～6周齡小鼠，購自武漢大學(xué)實驗動物中心，體重18～22 g，平均(20.31±0.72)g。Lewis肺癌瘤株購自上海信裕生物科技有限公司。DW-86L626型低溫冰箱購于四川蜀科儀器有限公司，LD-5M立式低速冷凍離心機購于青島海爾股份有限公司，精密移液器購于端士Socorex 公司，BIO-RAD酶標(biāo)儀購于美國 BIO-RAD伯樂公司。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Andy-gene公司提供)，包括小鼠外周血VEGF試劑盒(批號：HTAC017)、AS試劑盒(批號：HTAC011)、ES試劑盒(批號：HTAC023)、γ干擾素(IFN-γ)試劑盒(批號：HTAC015)、白細(xì)胞介素(IL)-2試劑盒(批號：HTAC012)、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(批號：HTAC009)。

1.2分組及接種方法 選取6只小鼠作為備用，其余80只小鼠隨機分為對照組、順鉑組、痰熱清組及聯(lián)合組，每組20只。除對照組外，其他3組均行Lewis肺癌瘤株接種處理：應(yīng)用37℃的溫水對Lewis肺癌瘤株進(jìn)行復(fù)蘇處理，并調(diào)整瘤株密度至1×107/ml。選擇2只備用小鼠，定位其右腋，分別皮下接種0.1 ml瘤株，11 d后以脫頸法處死小鼠，選擇生長狀態(tài)較好的癌組織進(jìn)行洗凈處理，剪碎、研磨，提取細(xì)胞。再選2只備用小鼠進(jìn)行第二輪接種。重復(fù)上述操作至第三輪接種后，將最后提取的腫瘤細(xì)胞分別接種于順鉑組、痰熱清組與聯(lián)合組小鼠的右腋皮下。

1.3治療方法 接種后1 d，對照組注射1.5 mg/kg的生理鹽水，隔天1次；順鉑組注射1.5 mg/kg順鉑(德州德藥制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023236)，隔天1次；痰熱清組經(jīng)腹腔注射痰熱清注射液(上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20030054)，劑量為3.5 ml/kg，隔天1次；聯(lián)合組注射1.5 mg/kg順鉑+3.5 ml/kg痰熱清注射液，隔天1次。4組均持續(xù)注射2 w。

1.4指標(biāo)觀察 (1)順鉑組、痰熱清組及聯(lián)合組小鼠接種5、10、14 d時的腫瘤體積。應(yīng)用動物腫瘤測量跟蹤系統(tǒng)，電子數(shù)顯卡尺測量腫瘤最長、最短徑，腫瘤體積=腫瘤最長徑×最短徑×最短徑/2〔5〕。(2)4組小鼠接種14 d后的免疫指標(biāo)水平。以免疫透射比濁法檢測小鼠外周血中免疫球蛋白(Ig)G、補體C3水平，取外周血離心分離血清，通過標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在波長340 nm處檢測血清IgG、補體C3水平，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。(3)4組的炎性因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)及血清VEGF、AS、ES水平。取4組小鼠適量股動脈血后靜置30 min，4 000 r/min離心15 min，取上層血清并保存于DW-86L626型低溫冰箱中備用。應(yīng)用酶標(biāo)儀并以ELISA法及其配套試劑盒檢測VEGF、AS、ES、IL-2、TNF-α、IFN-γ等水平，嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書操作。

1.5統(tǒng)計處理 采用SPSS20.0軟件，兩兩比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1順鉑組、痰熱清組及聯(lián)合組小鼠接種后5、10、14 d時的腫瘤體積 接種后5 d，3組腫瘤體積無明顯差異(P>0.05)；接種后10、14 d，3組腫瘤體積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組腫瘤體積明顯小于順鉑組及痰熱清組(P<0.05)，見表1。

表1 順鉑組、痰熱清組及聯(lián)合組接種不同時間的腫瘤體積比較

與順鉑組比較：1)P<0.05；與痰熱清組比較：2)P<0.05；與本組接種后5 d比較：3)P<0.05；與本組接種后10 d比較：4)P<0.05

2.24組免疫指標(biāo)比較 4組IgG與C3水平整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。痰熱清組IgG與C3水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；順鉑組、聯(lián)合組IgG與C3水平明顯低于對照組(P<0.05)，且聯(lián)合組的IgG與C3水平均明顯低于痰熱清組、高于順鉑組(P<0.05)。見表2。

表2 4組免疫指標(biāo)水平比較

與對照組比較:1)P<0.05；與順鉑組比較:2)P<0.05;與痰熱清組比較:3)P<0.05；下表同

2.34組炎性因子水平比較 4組IL-2、TNF-α及IFN-γ水平整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組、痰熱清組、聯(lián)合組的IL-2和IFN-γ水平均明顯低于對照組，TNF-α水平明顯高于對照組(P<0.05)；痰熱清組IL-2、IFN-γ水平明顯高于順鉑組，TNF-α水平明顯低于順鉑組(P<0.05)。聯(lián)合組的IL-2水平明顯高于順鉑組，TNF-α水平明顯高于痰熱清組，IFN-γ水平明顯低于痰熱清組(P<0.05)，見表3。

表3 4組炎性因子水平比較

2.44組VEGF、ES及AS水平比較 4組間VEGF、ES及AS水平整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組、痰熱清組、聯(lián)合組的ES、AS水平明顯低于對照組，VEGF水平明顯高于對照組(P<0.05)；聯(lián)合組、痰熱清組VEGF水平明顯低于順鉑組，ES水平明顯高于順鉑組(P<0.05)；痰熱清組AS水平明顯高于順鉑組(P<0.05)；聯(lián)合組ES、AS水平明顯低于痰熱清組，VEGF水平明顯高于痰熱清組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 4組VEGF、ES及AS水平比較

3 討 論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病早期無顯著癥狀，難以及時發(fā)現(xiàn)。多數(shù)患者就診時已進(jìn)入中晚期，根治性治療難度較大，可經(jīng)化療延長患者的生存時間及提高生存質(zhì)量〔6，7〕。但是，在患者化療治療期間，機體免疫能力會受化療藥物的影響。為了提升化療效果并且降低化療藥物對正常細(xì)胞、免疫能力的影響，臨床中常在化療期間采用中藥制劑輔助治療，痰熱清注射液即為其中較常用的一種。痰熱清注射液屬于中藥復(fù)方制劑，生物調(diào)節(jié)性較好，目前已在惡性腫瘤治療中獲得廣泛使用〔8〕。

本研究結(jié)果顯示，痰熱清注射液輔助化療能更有效降低小鼠腫瘤體積，提示痰熱清注射液輔助化療能增強化療的效果。痰熱清注射液主要由黃芩、山羊角、熊膽粉、連翹、金銀花等五味清熱的中藥組成，其中黃芩為君藥，具有清熱解毒、止咳潤肺的功效；山羊角和熊膽粉為臣藥，起到化痰止咳、解痙熄風(fēng)的作用；連翹、金銀花為佐藥，起到清熱解毒的作用〔9〕。痰熱清注射液可有效緩解肺癌小鼠咳嗽、咯痰等癥狀，聯(lián)合常規(guī)化療藥物順鉑可更好地改善小鼠的治療效果，進(jìn)而更有效地縮小腫瘤體積。本研究還顯示，使用順鉑進(jìn)行化療后，小鼠的免疫功能會受到一定的影響，而采用痰熱清注射液輔助化療可以減輕順鉑對小鼠免疫功能造成的影響。已有動物實驗證明，化療會導(dǎo)致小鼠的胸腺指數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、單根股骨骨髓細(xì)胞數(shù)降低，而痰熱清注射液輔助化療可明顯減輕這種現(xiàn)象，逆轉(zhuǎn)化療對小鼠免疫功能的影響〔10，11〕，這與本研究得到的結(jié)論相似，然而其具體的作用機制還有待進(jìn)一步研究。肺癌小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、活化T細(xì)胞會分泌大量IFN-γ，在抗腫瘤免疫過程中發(fā)揮重要的作用；TNF-α由巨噬細(xì)胞與活化T細(xì)胞分泌，參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過程；IL-2對細(xì)胞因子、干擾素成分可發(fā)揮誘導(dǎo)作用，對免疫調(diào)節(jié)有重要的作用，促進(jìn)Fas抗原表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果還顯示，順鉑可降低小鼠體內(nèi)IL-2和IFN-γ水平，增加TNF-α水平，而痰熱清注射液輔助化療可緩解IL-2和IFN-γ降低及TNF-α升高的程度，從而增強其淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫活性，在有效緩解炎性反應(yīng)的同時改善其免疫狀態(tài)〔12〕。VEGF是一種促進(jìn)外周血管生成的因子，主要通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K起到調(diào)控的作用〔13〕；AS和ES是重要的血管生成抑制因子，其中AS通過抑制腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移達(dá)到抑制血管生成的目的，而ES可以對新腫瘤血管的生成造成干擾。本研究顯示，順鉑化療后ES、AS水平降低，VEGF水平升高，而采用痰熱清注射液輔助化療可抑制這種趨勢，進(jìn)而抑制新生血管生成，避免腫瘤快速生長。

綜上所述，痰熱清注射液輔助化療可有效降低Lewis肺癌小鼠的腫瘤體積、增強免疫功能，可能是通過調(diào)節(jié)IL-2、TNF-α及IFN-γ等細(xì)胞因子的水平來調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能，通過抑制新生血管生長來縮小腫瘤體積，然而其具體的作用機制還有待更為深入的研究。