采用高通量測(cè)序研究足癬患者真菌群落的種類

賀 勤 宋鵬飛 陳加媛 徐 娟 王 京

足癬在全世界廣為流行，在熱帶和亞熱帶地區(qū)更為普遍。在我國(guó)足癬的發(fā)病率也相當(dāng)高?；趥鹘y(tǒng)的培養(yǎng)方式研究發(fā)現(xiàn)，主要的致病菌種以皮膚癬菌為主，但是念珠菌等其他致病菌的感染也有明顯增加[1]。盡管各種新的培養(yǎng)技術(shù)不斷出現(xiàn)，但傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度和特異性也較低，不能反應(yīng)全部的真菌群落信息，這很大程度上影響了足癬的診斷和治療。

與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比較，耗時(shí)短、通量大、準(zhǔn)確性高的分子生物學(xué)方法越來(lái)越普遍的用于分析和鑒定真菌群落多樣性。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始影響真菌生物學(xué)，逐步成為研究真菌群落多樣性的一個(gè)新的發(fā)展方向和熱點(diǎn)，增加了獲得新發(fā)現(xiàn)的機(jī)會(huì)[2，3]。本文采用高通量測(cè)序的方法，針對(duì)足癬患者足部真菌群落進(jìn)行分析和比較。通過(guò)大數(shù)據(jù)的挖掘，了解足癬患者足部真菌群落結(jié)構(gòu)、真菌的種類和數(shù)量分布特點(diǎn)。為進(jìn)一步優(yōu)化和控制真菌群落結(jié)構(gòu)提供參考數(shù)據(jù)，在預(yù)防和治療中可根據(jù)具體的真菌感染對(duì)其進(jìn)行各個(gè)擊破，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥和精確醫(yī)療的需求。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集我院門診就診的足癬患者，具體入組標(biāo)準(zhǔn)為：(a)臨床診斷為足癬，鏡檢或培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性；(b)3個(gè)月之內(nèi)未用過(guò)任何外用或口服抗生素類治療藥物。入組者均閱讀并簽署知情同意書(shū)。填寫信息采集記錄表(性別、年齡、病灶部位等信息)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 受試者的臨床類型主要為浸漬糜爛型和丘疹鱗屑型，采集部位分別為受試者的趾間和足底。使用消毒的棉簽拭子，生理鹽水浸潤(rùn)后，在受試者真菌感染的皮損部位和對(duì)稱健康部位反復(fù)刮取50次，獲得局部真菌群落。樣品采集后放入采樣管，并立即送至-80℃冰箱保存。

1.2.2 總DNA提取及高通量測(cè)序 使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明提取采集樣品總DNA。選用特異性引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和 ITS2R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)，以微生物總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品引物加入8bp的標(biāo)簽序列，用于區(qū)分不同的樣品，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，27個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物后，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, U.S.)回收純化目的條帶，采用QuantiFluor: trademark: ST(Promega, U.S.)對(duì)回收片段進(jìn)行定量?；厥掌伟凑斩炕旌虾蟛捎肐llumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)PE 250測(cè)序策略進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 高通量數(shù)據(jù)分析方法 過(guò)濾后的下機(jī)數(shù)據(jù)采用FLASH軟件(V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)拼接序列，使用Qiime軟件(V1.9.0,http://qiime.org/index.html)進(jìn)行序列質(zhì)控。使用 Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)對(duì)所有樣品的全部有效序列進(jìn)行97%水平聚類形成可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit, OTU)。使用Usearch軟件通過(guò)Silva(v128, http://www.arb-silva.de)進(jìn)行物種注釋(置信度閾值為0.8)。后續(xù)使用Qiime軟件進(jìn)行α多樣性的計(jì)算分析。使用R語(yǔ)言Vegan包中的Anosim分析樣品組間真菌群落結(jié)構(gòu)的差異。應(yīng)用方差分解，對(duì)多維數(shù)據(jù)降維，進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)，從而提取出數(shù)據(jù)中最主要元素和結(jié)構(gòu)。使用Metastat軟件進(jìn)行組間差異物種統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 有效樣品的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 成功獲取15例患者的24個(gè)有效樣品。病灶組(D組)15個(gè)樣本，其中取樣在趾間的9個(gè)樣本(DA組)，取樣在足底的6個(gè)樣本(DB組)；健康組(H組)9個(gè)樣本，其中取樣在趾間的4個(gè)樣本(HA組)，取樣在足底的5個(gè)樣本(HB組)。24個(gè)樣品通過(guò)Illumina平臺(tái)HiSeq2500測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾、拼接、去除嵌合體序列后，獲得的拼接序列平均長(zhǎng)度在190-300bp之間，每個(gè)樣品有效序列數(shù)目在3萬(wàn)條以上。經(jīng)過(guò)97%相似性聚類之后，剔除未注釋到的序列，共計(jì)獲得了1061個(gè)OTU。

2.2 真菌物種注釋分類結(jié)果 對(duì)全部OTU進(jìn)行物種注釋，共檢出6個(gè)菌門，分別為：擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和羅茲菌門(Rozellomycota)。其中子囊菌門和擔(dān)子菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌門，所占豐度比例分別為61.18%以及38.04%。兩個(gè)組共檢出283個(gè)屬，其中豐度最高的10個(gè)屬分別為毛癬菌屬(Trichophyton)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、念珠菌屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、枝孢屬(Cladosporium)、皮毛孢子菌屬(Cutaneotrichosporon)、枝孢霉菌屬(Amorphotheca)、青霉屬(Penicillium)。毛癬菌作為豐度最高的真菌，是足癬的主要致病菌，在D組中的豐度(24.98%)顯著高于H組(6.22%)。見(jiàn)表1。

2.3 組間真菌多樣性分析 α多樣性分析是對(duì)樣品中物種多樣性的分析，包含樣品中的物種組成的豐富度和均勻度兩個(gè)因素，通常用Shannon，Chao1，Observed species以及PD Whole Tree等指數(shù)來(lái)評(píng)估樣本的物種多樣性，指數(shù)越高，表明樣本的多樣性越復(fù)雜。對(duì)兩組樣品進(jìn)行α多樣性分析，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示兩組樣品在這4種物種多樣性水平上差異均不顯著(P值分別為0.305，0.0721，0.0725，0.224)，說(shuō)明足癬患者病灶部位的真菌群落多樣性與對(duì)稱健康部位的真菌群落多樣性相近。

表1 足癬患者足部真菌種類豐度 (%)

圖1組間真菌多樣性比較

2.4 組間真菌群落結(jié)構(gòu)的差異 根據(jù)取材部位不同，又將病灶組和健康組分成了趾間病灶組(DA)、足底病灶組(DB)、趾間健康組(HA)和足底健康組(HB)。Anosim分析顯示：DA與HA兩組間真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，其它三組間差異不顯著。見(jiàn)表2。

表2 組間真菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

對(duì)DA與HA兩組樣品進(jìn)行PCA分析發(fā)現(xiàn)：DA與HA組樣品均具有明顯的聚集，DA組本身又分為偏裸囊菌科(Arthrodermataceae)以及偏毛孢子菌科(Trichosporonaceae)型兩種類型，而健康對(duì)照HA組更傾向叢赤殼科(Nectriaceae)。將DA組按照PCA分布拆分分組為DA1和DA2兩組，通過(guò)Metastat檢驗(yàn)結(jié)論為毛孢子菌科在DA2組的豐度顯著高于DA1組以及HA組(P=0.00，P=0.00)；裸囊菌科在DA1組與DA2組的豐度顯著高于HA組(P=0.00，P=0.00),見(jiàn)圖2?；诟鳂悠返脑诳扑缴系奈锓N豐度信息進(jìn)行主成分分析，用分析得到的第1、2主成分對(duì)樣品進(jìn)行畫(huà)圖，得到圖2a結(jié)果。其中PC1表示由樣本相對(duì)豐度信息提取到的第1主成分，31.6%表示主成分1對(duì)樣本科水平差異的解釋率；PC2表示由樣本豐度信息提取的第2主成分，20.9%表示主成分二對(duì)樣本科水平差異的解釋率。箭頭連線與橫豎坐標(biāo)軸的夾角表示該物種與該主成分的相關(guān)性，夾角越小表示相關(guān)性越小。如，裸囊菌科與PC1的夾角大于與PC2的夾角，說(shuō)明裸囊菌科與第1個(gè)主成分的相關(guān)性比第2個(gè)主成分高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，裸囊菌科中毛癬菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，毛孢子菌科中毛孢子菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，叢赤殼科中鐮刀菌屬為優(yōu)勢(shì)菌。

圖22a,2b PCA分布(科水平)及相關(guān)物種豐度

3 討論

皮膚是人體的最大器官，其上定植著大量的微生物菌群，在防御和對(duì)抗病原體入侵、免疫系統(tǒng)訓(xùn)練及穩(wěn)態(tài)維持中起著重要的作用。寄生在皮膚表面的微生物群落與人體相互依存、相互影響，形成了在人體皮膚結(jié)構(gòu)功能中發(fā)揮重要作用的微生態(tài)環(huán)境。在微生態(tài)系統(tǒng)被破壞的情況下，可能導(dǎo)致皮膚病甚至全身性疾病[4]。因此研究皮膚微生物群落的組成特點(diǎn)對(duì)于闡明皮膚病的病因?qū)W是有價(jià)值的。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于銀屑病、特應(yīng)性皮炎的微生物菌群有較多的研究[5,6]。對(duì)于足癬這類病種的微生物群落研究，罕有報(bào)道。

本次研究中，足部皮膚真菌群落以子囊菌門和擔(dān)子菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌門，這一分布特點(diǎn)與以往的研究結(jié)果一致[7]。所有樣本總共檢測(cè)出283個(gè)屬，說(shuō)明足部真菌種類豐富，群落結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性較高，可能為致病菌提供感染機(jī)會(huì)。病灶組的優(yōu)勢(shì)菌為毛癬菌屬，它的含量顯著高于健康組，符合毛癬菌是足癬主要致病菌的傳統(tǒng)研究結(jié)果[8]。另外，毛孢子菌屬、曲霉屬、念珠菌屬、紅酵母屬等這些條件致病菌也在足癬患者的病灶部位或健康部位定植分布，它們的存在是否影響局部皮膚的微生態(tài)穩(wěn)定，是否參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，在足癬的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了何種作用，這些都有待于進(jìn)一步研究和探討。

對(duì)于真菌多樣性分析的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)足癬患者的病灶部位真菌群落多樣性和對(duì)稱的健康部位相近，說(shuō)明多樣性水平的高低對(duì)于足部健康的影響有限。但在我國(guó)北方的研究人員發(fā)現(xiàn)，足癬患者足部的真菌群落多樣性要顯著低于健康人群[9]。研究結(jié)果的不一致，可能與取材的具體部位、皮損的患病程度以及研究所處的地理位置和氣候環(huán)境差異有關(guān)[2,7]。我們還需加大樣本數(shù)量，強(qiáng)化分析方法，進(jìn)一步驗(yàn)證和精確我們的分析結(jié)果。

本次研究我們還發(fā)現(xiàn)，足癬患者病灶趾間部位的真菌群落結(jié)構(gòu)與對(duì)稱的健康部位存在差異。根據(jù)優(yōu)勢(shì)菌種的分布不同，DA組又顯著分成了DA1組和DA2組，分別富含致病菌毛癬菌屬和條件致病菌毛孢子菌屬，說(shuō)明不同足癬患者趾間部位的優(yōu)勢(shì)菌種有所不同，這可能是足癬進(jìn)行單一治療方案效果不佳的原因。對(duì)于足癬患者在今后的診療過(guò)程中，應(yīng)針對(duì)真菌群落組成，采用個(gè)性化治療方案。