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    全國主栽棉花品種棉籽氨基酸組分分析及質量初步評價研究

    2019-06-06 02:58:02王爽榮夢杰金云倩王延琴
    中國棉花 2019年5期
    關鍵詞:甲硫氨酸棉籽賴氨酸

    王爽,榮夢杰,金云倩,王延琴

    (棉花生物學國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部棉花產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所,河南 安陽 455000)

    棉花是關系國計民生的大宗農(nóng)產(chǎn)品,既是紡織工業(yè)主要的原材料,也是我國重要的油料作物。棉花纖維是重要的紡織原料,同時伴隨其生產(chǎn)的更多數(shù)量的棉籽因含有豐富的氨基酸、脂肪酸、維生素等成分,同樣是我國食用油、食用菌、飼料、纖維素行業(yè)的重要原材料[1]。棉籽與稻米、小麥等谷類作物不同,其蛋白質成分具有良好的氨基酸組成,含有人體所需的8 種必需氨基酸,屬于全價蛋白質,其含量組成接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織推薦的水準[2]。另外在社會發(fā)展需求方面,近些年來隨著人們生活水平的提高,對肉、蛋、奶等的需求日益增加,促進了我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展,進而提高了畜牧養(yǎng)殖飼料原料的消費量,最終造成了我國畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的迅速發(fā)展與飼料蛋白資源緊缺的矛盾日益突出。而現(xiàn)有的植物蛋白質資源未得到充分利用,棉籽原料多、蛋白品質高,具有巨大的利用開發(fā)潛力,為解決這一矛盾提供了一種選擇路徑。因此,棉籽作為一種重要的植物蛋白資源,提高棉籽蛋白質含量和改良氨基酸組成既是棉花育種的目標,也有利于棉籽產(chǎn)品下游的綜合開發(fā)利用,對于緩解蛋白資源的緊缺現(xiàn)狀和農(nóng)業(yè)的提質增效具有十分重要的意義。

    本研究采用鄰苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯(FMOC)聯(lián)合柱前衍生,基于外標法對棉籽中的氨基酸組成進行定性和定量分析。OPA 和FMOC均為氨基酸分析中的柱前衍生試劑[3],原理是在3-巰基丙酸 (3-MPA) 存在下,一級氨基酸首先與OPA 反應,而二級氨基酸不和OPA 反應,然后再利用FMOC 進行衍生。使用Advance Bio AAA 氨基酸專用柱分離,梯度洗脫,二極管陣列檢測器(DAD)檢測,測定棉籽中氨基酸含量。本方法的優(yōu)點在于分析時間短(18 min)、準確性好、靈敏度高和樣品前處理簡單[4]。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料及試劑

    1.1.1試驗材料。2015―2016年采集于我國長江流域、 黃河流域和西北內陸三大主產(chǎn)棉區(qū)主栽棉花棉籽樣品305 份(表1),代表了我國棉花生產(chǎn)的現(xiàn)狀。

    1.1.2儀器與試劑。Agilent1100 系列高效液相色譜儀, 配有真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器DAD。

    表1 各省份采集樣品數(shù)量

    試劑:鄰苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯、巰基丙酮、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、濃鹽酸、乙腈、甲醇、硼酸、磷酸、氫氧化鈉、17 種氨基酸混合標準液。

    氨基酸混合標準液的配制: 將濃度為2.5 mmol·L-1的 17 種氨基酸混合標準液稀釋,配制成濃度分別為 4.5、45、225、450 和 900 μmol·L-1的混合標準溶液。

    1.2 試驗方法

    色譜柱: 安捷倫 4.6*100 mm Advance Bio AAA 柱。

    流動相 A: 稱取 1.4 g 無水 Na2HPO4和 3.8 g Na2B4O7·10H2O,將其溶于 1 L 水中。用 1.2 mL 濃鹽酸將pH 調節(jié)為8.2。

    流動相B:乙腈∶甲醇∶水(45∶45∶10, v∶v∶v),所有流動相溶劑均為HPLC 級。

    洗脫梯度:0.0~0.35 min (B:2%),0.35~13.4 min(B:2%~57%),13.4~13.5 min(B:57%~100%),13.5~15.7 min(B:100%),15.7~15.8 min(B:100%~2%),15.8~18.0 min(B:0%)。

    二極管陣列(DAD)檢測器:

    信號A:波長 338 nm、帶寬10 nm、參比波長390 nm、帶寬20 nm;

    信號B:波長 262 nm、帶寬16 nm、參比波長324 nm、帶寬8 nm。

    在線自動衍生程序:從瓶1 中吸取2.5 μL(硼酸緩沖液); 吸取 0.5 μL 樣品;“在空氣中” 混合 3 μL,最大速度,2 次;靜置 0.5 分鐘;從瓶 2 中吸取 0 μL(用未加瓶蓋中的水清洗針頭);從瓶3 中吸取0.5 μL(OPA);“在空氣中”混合 3 μL,最大速度,6次;從瓶2 中吸取0 μL(用未加瓶蓋中的水清洗針頭);從瓶 4 中吸取 0.5 μL(FMOC);“在空氣中”混合 4 μL,最大速度,6 次;從瓶 5 中吸取 32 μL(進樣稀釋劑);“在空氣中”混合 18 μL,最大速度,2 次。

    氨基酸的提取: 每份樣品各取0.1 g 加10 mL濃度為 6 mol·L-1的鹽酸(含 0.1%苯酚),通氮氣 1 min,于110℃干燥箱或恒溫模塊中水解22~24 h,取出冷卻至室溫,過濾至10 mL 容量瓶并定容,取1 mL 于試管,通氮氣吹干,再加 0.1 mol·L-1的鹽酸 2 mL 溶解稀釋,渦旋混合,過 0.45 μm 濾膜,裝瓶進樣。

    1.3 樣品測定及分析

    在相同流動相和衍生條件下,每個樣品重復3次,實驗結果取平均值,并采用SPSS 23.0、Origin 8.0 軟件等做統(tǒng)計分析。

    2 結果與分析

    2.1 棉籽氨基酸組成的定性分析

    首先,對棉籽中的氨基酸組分進行定性分析,在流速 1.0 mL·min-1、 柱溫箱 40 ℃、338 nm 波長條件下檢測出混合標準品中的顯著的16 種氨基酸目標峰,但標準品中的脯氨酸未識別。通過色譜條件優(yōu)化,在相同流速和溫度時,在262 nm 檢測波長下能夠檢出脯氨酸目標峰(圖1A)?;诖朔N方法,我們對棉籽樣品中的氨基酸組分進行識別,能夠檢測到17 種氨基酸成分(圖1B)。需要注意的是,本方法沒有進行色氨酸的檢測,原因是本研究采用鹽酸水解,而在氨基酸分析中,酸水解時色氨酸在110 ℃用 6 mol·L-1鹽酸水解超過 24 h 會被全部破壞[5]。

    2.2 棉籽總氨基酸定量分析

    通過HPLC 化學工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),按峰面積外標法進行定量分析,求得各氨基酸的平均含量,如表2 所示。所有樣品本棉籽中總氨基酸含量在32.5%~49.5%之間,總氨基酸平均含量為40.65%,符合黃莊榮報道的棉籽氨基酸總含量范圍[6]。就各氨基酸在樣品間相對含量的分布來看,蘇氨酸含量的變異系數(shù)遠大于其他氨基酸,達到25.95%。谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸變異系數(shù)小于10%,其余12 種氨基酸變異系數(shù)均大于10%。從各氨基酸的變異系數(shù)來看,說明本實驗抽樣樣品離散程度大,能夠代表我國棉籽中各氨基酸含量的分布情況。

    圖1 棉籽氨基酸混合標準品(圖A)和樣品(圖B)的液相色譜圖

    表2 各省份采集樣品數(shù)量

    表2 (續(xù))

    按照樣品地區(qū)分析,新疆、河北產(chǎn)地的棉籽氨基酸含量相對較集中 (取樣品數(shù)量較多的五個產(chǎn)地),河南省氨基酸平均含量高于其他各省,這次實驗樣品數(shù)目最多的新疆和安徽地區(qū)總氨基酸含量沒有差異,新疆地區(qū)氨基酸平均含量為400.33 mg·g-1,安徽地區(qū)氨基酸平均含量為 406.79 mg·g-1(P>0.05)。

    圖2 樣品數(shù)量較多的不同省份各樣品氨基酸總含量

    2.3 必需氨基酸分析

    常見的必需氨基酸 (包括條件必需氨基酸)為賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸等,棉籽中該類必需氨基酸占總氨基酸平均含量29.6%。賴氨酸作為很多植物性飼料中主要的限制氨基酸占棉籽總氨基酸含量的4.75%,與其他油料相比含量較低,為第一限制性氨基酸。所以當利用棉籽餅粕為原料配制混合飼料時,需要注意氨基酸平衡,額外添加賴氨酸進行補充。另外,賴氨酸在棉籽粕中利用率不高[7],是由于棉籽中的棉酚會和賴氨酸中ε-氨基結合發(fā)生美拉德反應,褐變生成不溶性復合物,降低賴氨酸利用率[8],所以有部分地區(qū)把棉籽粕用作肥料,脫毒后用于飼料[9]。甲硫氨酸在畜禽飼養(yǎng)中起到促進畜禽生長、增加瘦肉量的作用,棉籽中甲硫氨酸占總氨基酸含量的2.26%,但甲硫氨酸毒性較強,也不宜在飼料中添加過量[10]。

    2.4 非必需氨基酸

    棉籽中的非必需氨基酸為天冬氨酸、 谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、脯氨酸,占棉籽總氨基酸平均含量的70.4%。其中含量最高的是谷氨酸,達到 68.27~128.04 mg·g-1,平均含量為 97.69 mg·g-1。精氨酸作為一種功能性氨基酸在棉籽中含量較高,平均含量達到59.00 mg·g-1,屬于棉籽有代表性的氨基酸種類。精氨酸可控制體內細胞的退化、降低血氨和增加肌肉活力等功能,對禽畜的生長、繁殖、免疫性能都有重要作用[11]。丙氨酸在棉籽中平均含量為 18.10 mg·g-1,作為某些功能性氨基酸代謝的含氮產(chǎn)物,有利于內臟氮循環(huán)機制,在仔豬生長中起到增強豬免疫和生糖作用[12]。

    2.5 氨基酸間的相關性分析

    氨基酸處于代謝網(wǎng)絡的各個位置,不同氨基酸之間存在著特定的相關性,棉籽中不同氨基酸間的相關性分析結果見表3。棉籽中蘇氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸相對于其他氨基酸顯著性系數(shù)較小,甲硫氨酸相對其他大部分氨基酸無顯著相關性; 谷氨酸、酪氨酸與總氨基酸呈顯著相關性,相關性系數(shù)大于0.9;精氨酸作為棉籽中的代表性氨基酸,除了與蘇氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸無顯著相關外,與其余氨基酸均呈顯著性相關。苯丙氨酸與酪氨酸相關性系數(shù)達0.78,顯著相關,這與苯丙氨酸在體內被攝取后

    部分經(jīng)肝臟苯丙氨酸羥化酶的作用轉變?yōu)槔野彼嵊幸欢P聯(lián)。

    表3 棉籽不同氨基酸間的相關系

    2.6 棉籽樣本基于氨基酸組成的聚類分析

    對305 份棉籽的氨基酸含量構成進行分類(圖3),在距離為16 處將全部樣品分成五類,第Ⅰ類包括236 份棉籽,表現(xiàn)為精氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸含量中等;第Ⅱ類包括53 份棉籽,表現(xiàn)為甲硫氨酸含量中等,精氨酸、賴氨酸含量較高;第Ⅲ類包括1 份棉籽,表現(xiàn)為賴氨酸含量較低,精氨酸含量較高,甲硫氨酸含量中等;第Ⅳ類包括13 份棉籽,表現(xiàn)為精氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸含量均較低;第Ⅴ類包括2份棉籽,表現(xiàn)為精氨酸、甲硫氨酸含量較低,賴氨酸含量較高。第Ⅱ類的53 份棉籽氨基酸總含量較高,具有作為高品質飼料原料的潛力,但精氨酸與賴氨酸間存在拮抗作用[13],二者的適宜比例對促進家禽生長和生產(chǎn)性能有重要意義,其深層次機理還有待進一步研究。

    圖3 305 份樣品精氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、總氨基酸含量聚類分析結果

    3 討論與結論

    305 份棉籽氨基酸總含量為40.65%,谷氨酸、精氨酸含量較高,蘇氨酸、胱氨酸含量較低。必需氨基酸占29.6%,非必需氨基酸占70.4%。聚類分析將樣品分為五類,其中第Ⅱ類的53 份棉籽表現(xiàn)為甲硫氨酸含量中等,精氨酸、賴氨酸含量較高,但精氨酸與賴氨酸的適宜比例及深層次機理還有待探討。隨著飼料研發(fā)技術的不斷進步,棉籽作為飼料原料將有廣闊的應用前景。

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