清醬肉多肽的抗氧化活性和氨基酸分析

王樂 李享 劉文營(yíng) 楊凱 曲超 成曉瑜

摘 要：以清醬肉為研究對(duì)象，提取并通過超濾分離得到清醬肉多肽（分子質(zhì)量<10 kDa），測(cè)定不同質(zhì)量濃度多肽液對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）的清除效果、Fe2+螯合能力和還原能力，分析清醬肉多肽的氨基酸組成。結(jié)果表明：當(dāng)清醬肉多肽液的質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH和DPPH自由基的清除率分別可達(dá)51.49%和57.50%，與相同質(zhì)量濃度的谷胱甘肽（glutathione，GSH）相比差異顯著（P<0.05）;清醬肉多肽的Fe2+螯合能力隨其質(zhì)量濃度的增加而顯著提高，當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，其對(duì)Fe2+的螯合率可達(dá)50.97%;清醬肉多肽還具有一定的還原性。此外，清醬肉多肽液的氨基酸組成較為豐富，其中必需氨基酸含量為29.14%;與抗氧化活性相關(guān)的堿性、酸性及疏水性氨基酸的總量達(dá)到87.75%。綜上所述，清醬肉多肽液具有一定的抗氧化能力及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

關(guān)鍵詞：清醬肉;多肽;抗氧化性;氨基酸分析

中圖分類號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）02-0019-06

Abstract： In this experiment， peptides （molecular mass < 10 kDa） were extracted from pickled sauced meat and separated by ultrafiltration. Antioxidant activities of the peptides were evaluated by determining scavenging activities against 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and hydroxyl radicals， Fe2+ chelating capacity and reducing power. Furthermore， the amino acid composition was analyzed. The results showed that the percentage scavenging of hydroxyl and DPPH radicals by the peptides at 5.0 mg/mL was 51.49% and 57.50%， respectively， highly significantly different from that by glutathione （GSH） at the same concentration （P < 0.05）. The Fe2+ chelating capacity of the peptides was significantly concentration-dependently enhanced， and at a concentration of 5 mg/mL， the percentage chelating of Fe2+ was 50.97%. Also the peptides showed reducing power. In addition， the amino acid composition of the peptides was abundant， with essential amino acids accounting for 29.14% of the total amino acids. The content of antioxidant amino acids including acidic amino acid， basic amino acid and hydrophobic amino acid was as high as 87.75%. In summary， the peptides extracted from pickled sauced meat has antioxidant activity and nutritional value.

自由基是一類具備極強(qiáng)氧化能力的含有未成對(duì)電子的原子或分子，通常相當(dāng)不穩(wěn)定且化學(xué)性質(zhì)非?；顫奫1-2]，具有氧化生物分子的能力。研究發(fā)現(xiàn)，自由基的過度產(chǎn)生與很多病理過程相關(guān)，不僅會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)和碳水化合物等造成氧化損傷，還可能引發(fā)DNA變異，甚至造成組織器官的老化和疾病的發(fā)生[3]。目前，許多從食物蛋白中提取的多肽已被證實(shí)具有抗氧化活性，可以作為自由基清除劑和金屬離子的螯合劑，保護(hù)細(xì)胞免受由活性氧引起的氧化損傷[4-5]。與合成抗氧化劑相比，這些生物活性肽通常分子質(zhì)量較小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有較高活性，并且易于吸收，沒有潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)[6]。肉類和肉制品是良好的抗氧化肽來源[7-9]。蛋白水解通常是肉制品成熟過程中產(chǎn)生的重要生物化學(xué)反應(yīng)[10]，在內(nèi)源酶作用下蛋白質(zhì)發(fā)生降解，促使許多小分子肽類和游離氨基酸生成[11-13]。這些生物活性肽的抗氧化特性在很大程度上取決于肽的性質(zhì)，如分子質(zhì)量、氨基酸組成及其序列[14-15]。Sun Weizheng等[16]通過超濾將不同干燥時(shí)期的廣式臘腸多肽液分成2 種多肽組分（>5 kDa和<5 kDa），發(fā)現(xiàn)在干燥后期分子質(zhì)量低于5 kD的肽液表現(xiàn)出較高的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性;并且發(fā)現(xiàn)Glu、Gly和Arg是組成多肽的重要氨基酸。

Zhu Chaozhi等[10]從金華火腿中分離純化出的序列為GKFNV的小肽具有較高的抗氧化活性。陳好春等[17]將風(fēng)味蛋白酶添加到腌臘雞腿中，發(fā)現(xiàn)腌臘雞腿蛋白多肽液具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

清醬肉是一類以五花豬肉為基本原料，用食鹽、醬料等腌制后，通過風(fēng)干等工藝加工制成的肉制品。一般產(chǎn)品表面色澤紅亮、肉香撲鼻、具有獨(dú)特的腌臘風(fēng)味[18]。盡管現(xiàn)在已有一些關(guān)于干腌肉制品中天然抗氧化肽的研究報(bào)道，但主要針對(duì)從火腿中提取的生物活性肽，關(guān)于臘肉肽液的抗氧化性鮮有報(bào)道[19-20]。關(guān)于清醬肉中多肽抗氧化活性及氨基酸組成等方面的研究目前還沒有相關(guān)報(bào)道。本研究通過超濾分離出清醬肉多肽（分子質(zhì)量<10 kDa），并以相同質(zhì)量濃度的谷胱甘肽（glutathione，GSH）為對(duì)照，探討不同質(zhì)量濃度多肽液的自由基清除能力、Fe2+螯合能力和還原能力，并解析其氨基酸構(gòu)成，為今后清醬肉抗氧化肽的機(jī)理及結(jié)構(gòu)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬五花肉（豬腹部） 北京二商大紅門肉類食品有限公司;加工原、輔料 北京食品科學(xué)研究院香辛料部。

DPPH、GSH、鄰二氮菲 美國(guó)Sigma公司;菲洛嗪（Ferrozine） 生工生物工程（上海）股份有限公司;鐵氰化鉀、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）二鈉鹽、FeCl3、鹽酸、苯酚 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司;D-500勻漿機(jī) 德國(guó)Wiggens公司;N-1100D-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀? ?日本Eyela器械株式會(huì)社;Sorvall LYNX-4000離心機(jī)、Evolution 220紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司;LGJ-30D凍干機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司;Milli-Q Reference超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;Vortex-5渦旋混合器 海門市Kylin-Bell儀器制造有限公司;Synergy H4酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司;L-8900氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 清醬肉的加工工藝

將精品豬五花肉解凍后修整成規(guī)格為3 cm×4 cm×30 cm的肉條;與白砂糖、食鹽、味精等輔料充分混勻，在真空滾揉機(jī)中于4 ℃條件下共腌制12 h;將醬料、曲酒等輔料放入滾揉機(jī)中再繼續(xù)輥揉12 h;之后將肉條放置于煙熏爐中，50 ℃烘干1 h;烘干后置于恒溫恒濕箱（溫度12 ℃、相對(duì)濕度45%）中風(fēng)干成熟15 d，真空包裝。

1.3.2? 清醬肉多肽的提取

參考Zhang Siyu等[21]的方法。取清醬肉肉樣，剔除脂肪，將瘦肉切碎、斬勻后準(zhǔn)確稱取25 g，加入100 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2），冰浴勻漿（10 000 r/min，10 min）;將勻漿液于4 ℃靜置20 min后，4 ℃條件下離心（12 000 ×g、20 min）;取上清液，首先濾掉上層漂浮的油脂，再加入3 倍體積的40%乙醇溶液，在4 ℃靜置4 h后，再次于4 ℃條件下離心（12 000 ×g、20 min）;取上清液真空抽濾，采用截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 kDa的超濾膜進(jìn)行過濾，收集濾液真空冷凍干燥后即為多肽粉，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考Wang Lusha[8]的方法。將清醬肉多肽配制成質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的多肽液，以對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的GSH溶液作為對(duì)照組。將DPPH自由基溶液（0.2 mmol/L，95%乙醇）與多肽液按體積比1∶1混合，搖勻，室溫下靜置30 min后于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，即為樣品管吸光度。對(duì)照管為DPPH自由基溶液（0.2 mmol/L，95%乙醇）與去離子水按體積比1∶1混合，空白管為樣品液與95%乙醇按體積比1∶1混合。DPPH自由基清除率按照公式（1）計(jì)算。

1.3.4 ·OH清除率測(cè)定

參考Li Yanhong等[22]的方法。將清醬肉多肽配制成質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL的多肽液，以對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的GSH溶液作為對(duì)照組。取0.3 mL鄰二氮菲溶液（5 mmol/L），加入0.2 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.4），充分混勻后，加入0.3 mL樣品溶液和0.3 mL EDTA二鈉鹽（15 mmol/L），再次混勻，加入0.3 mL FeSO4溶液（5 mmol/L）及0.4 mL H2O2（0.1%），混勻后37 ℃保溫1 h，測(cè)定其在536 nm波長(zhǎng)處的吸光度，即為樣品管吸光度（A樣品）。以去離子水替代多肽液，其余操作同樣品管，測(cè)得吸光度為A損傷。以去離子水代替H2O2，測(cè)得吸光度為A未損傷。·OH清除率按照公式（2）計(jì)算。

1.3.5 Fe2+螯合能力測(cè)定

參考Lee等[23]的方法。將清醬肉多肽配制成質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的多肽液，以對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的GSH溶液作為對(duì)照組。吸取1 mL多肽液于試管中，加入0.05 mL 2 mmol/L FeCl2，混勻后加入0.2 mL菲洛嗪（5 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩混勻，室溫下靜置10 min，測(cè)定562 nm波長(zhǎng)處的吸光度。Fe2+螯合率按照公式（3）計(jì)算。

1.3.6 還原能力測(cè)定

參考蔡俊等[24]的方法。將清醬肉多肽配制成質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的多肽液，以對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的GSH溶液作為對(duì)照組。取1 mL多肽液、2 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）和2 mL鐵氰化鉀溶液（1 g/100 mL）混合，在恒溫水浴鍋中50 ℃放置20 min后迅速冷卻;加入2 mL TCA（10 g/100 mL），充分混勻，4 000 r/min離心10 min;取2 mL上清液，加2 mL去離子水和0.4 mL三氯化鐵溶液（0.1 g/100 mL），振蕩混合均勻，靜置15 min后，測(cè)定700 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.7 清醬肉多肽的的氨基酸組成分析

稱取一定質(zhì)量的清醬肉多肽粉，用10 mL 6 mol/L的HCl溶解，加入4 滴苯酚，放入冷凍劑中冷凍5 min，重復(fù)抽真空-充入氮?dú)? 次，在第3次充氮?dú)鈺r(shí)封口;已封口的水解管放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，在110 ℃條件下恒溫水解22 h，之后取出冷卻到室溫;水解液經(jīng)中速定性濾紙過濾，濾液在50 mL容量瓶中定容，取1 mL濾液于試管中，濃縮蒸干;最后，加入1 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液充分溶解，混勻，0.22 μm濾膜過濾，然后用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

全部指標(biāo)均測(cè)定3 個(gè)平行，最終數(shù)值記為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件分析，用Origin 8.0軟件整理數(shù)據(jù)和繪圖，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance，ANVOA）和Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 清醬肉多肽對(duì)DPPH自由基的清除效果

DPPH自由基是一種以氮原子為中心而穩(wěn)定存在的自由基，其于517 nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收。當(dāng)抗氧化劑存在時(shí)，抗氧化物質(zhì)具有提供電子與DPPH孤對(duì)電子配對(duì)而使其褪色的能力[25]。目前DPPH自由基清除率是一種考察抗氧化能力的重要評(píng)價(jià)方式，清除率越大，抗氧化性越強(qiáng)。

由圖1可知，當(dāng)質(zhì)量濃度在1.0～5.0 mg/mL時(shí)，清醬肉多肽對(duì)DPPH自由基的清除率隨溶液質(zhì)量濃度的增大而提高，且與GSH溶液均表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力。清醬肉多肽質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率為35.01%，顯著低于同質(zhì)量濃度的GSH（P<0.05）。Zhang等[26]采用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶水解大米蛋白，所得產(chǎn)物質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除活性分別為44.31%和35.26%。清醬肉多肽清除50% DPPH自由基時(shí)的質(zhì)量濃度為2.85 mg/mL（半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值），雖顯著低于同質(zhì)量濃度的GSH（P<0.05），但是與諾鄧火腿粗肽液基本相當(dāng)[20]。

DPPH自由基屬于脂溶性自由基。分子質(zhì)量低于5 kDa的短肽對(duì)DPPH自由基具有較好的清除作用，且肽鏈越長(zhǎng)，清除率越低，這可能與短肽具有疏水作用有關(guān)[27]。清醬肉多肽所表現(xiàn)出的自由基清除效果可能與蛋白質(zhì)降解過程中形成的短肽有關(guān)，從DPPH自由基清除活性評(píng)估中推斷該多肽中可能存在一些由疏水性氨基酸組成的肽段。

2.2 清醬肉多肽對(duì)·OH的清除效果

OH是機(jī)體內(nèi)活性最強(qiáng)的一類自由基，可與機(jī)體內(nèi)不同種類的生物大分子發(fā)生作用，破壞其生物功能，威脅人體健康[28]。因此，·OH清除能力被認(rèn)為是一個(gè)可以用來衡量抗氧化劑發(fā)揮抗氧化性能的重要指標(biāo)。

由圖2可知，清醬肉多肽對(duì)·OH的清除具有劑量依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度逐漸增加時(shí)，清醬肉多肽的·OH清除能力也不斷提高。質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，清醬肉多肽對(duì)·OH的清除率達(dá)51.49%，相比于GSH溶液降低27.80%，差異顯著（P<0.05）。Saidi等[29]在用風(fēng)味蛋白酶水解金槍魚加工副產(chǎn)物的報(bào)道中指出，所得多肽液的·OH清除效果受肽的分子質(zhì)量和氨基酸組成的影響，分子質(zhì)量較低的肽，其·OH清除能力強(qiáng)于高分子質(zhì)量肽，而一些芳香族氨基酸和疏水性氨基酸有助于增強(qiáng)多肽液的·OH清除能力。Ko等[30]從海洋小球藻中純化的抗氧化肽清除·OH時(shí)的IC50為2.70 mg/mL。因此，可以推斷清醬肉中含有一些抗氧化肽，可以將自由基轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的產(chǎn)物并終止自由基鏈反應(yīng)。

2.3 清醬肉多肽的Fe2+螯合能力

過渡金屬離子（Fe2+和Cu2+）能夠作為自由基產(chǎn)生的媒介，促進(jìn)活性氧的生成，如·OH和超氧陰離子自由基，從而對(duì)食品組分和人體健康造成較大威脅[31]?？寡趸瘎┛梢詫?duì)金屬離子的催化活性造成影響，從而抑制其催化氧化的過程，因此Fe2+螯合能力被認(rèn)為是衡量抗氧化能力的有效方法之一。

由圖3可知，當(dāng)質(zhì)量濃度逐漸增大時(shí)，清醬肉多肽的Fe2+螯合能力顯著提高（P<0.05），從質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)的11.01%提高到5 mg/mL時(shí)的50.97%，顯著高于GSH（P<0.05）。與GSH相比，清醬肉多肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的Fe2+螯合能力，這可能與清醬肉多肽中含有較多由中性和酸性氨基酸組成的肽段有關(guān)[10]。短肽中暴露的酸性氨基酸因帶有游離羧基而具有螯合Fe2+的能力，從而抑制自由基的產(chǎn)生。

2.4 清醬肉多肽的還原能力

一定程度上，還原能力能夠反映抗氧化劑提供電子的能力?？寡趸瘎┩ǔ？梢酝ㄟ^提供電子抑制活性氧的產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)清除自由基的效果。因此抗氧化劑提供電子能力的強(qiáng)弱可用于表示其抗氧化活性的強(qiáng)弱。在波長(zhǎng)700 nm處的吸光度越大，還原能力就越強(qiáng)，抗氧化活性也就越強(qiáng)[32]。

由圖4可知，清醬肉多肽的還原能力隨其質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，在5 mg/mL時(shí)其還原能力達(dá)到最高，但始終顯著低于GSH（P<0.05），這表明清醬肉多肽的抗氧化能力隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸提高。劉文穎等[33]對(duì)大豆低聚肽體外抗氧化能力進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其還原能力與質(zhì)量濃度呈正比，即隨著質(zhì)量濃度的增大，其還原能力會(huì)不斷提高。清醬肉多肽的還原能力可能是由于一些肽段含有具備供氫能力的氨基酸殘基。

2.5 清醬肉多肽的氨基酸組成分析

多肽的抗氧化性與其氨基酸構(gòu)成有很大關(guān)系[16]。肽段中包含的酸性氨基酸（Glu、Asp）和堿性氨基酸（Arg、His、Lys）有助于抗氧化肽獲得較好的金屬離子螯合能力和自由基清除能力[34]。此外，含有一個(gè)或幾個(gè)疏水性氨基酸（如Tyr、Ala、Met、Val、Phe、Ile、Leu和Pro）的肽鏈可以更好地存在于水-脂質(zhì)界面處，以提高多肽的自由基清除能力[35]。Najafian等[36]用木瓜蛋白酶酶解巴丁魚肌原纖維蛋白，提取到3 種抗氧化肽，其中FVNQPYLLYSVHMK的抗氧化活性最強(qiáng)，認(rèn)為肽段中疏水性氨基酸殘基Leu、Val、Phe對(duì)抗氧化能力貢獻(xiàn)較大。

由表1可知，清醬肉多肽中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的29.14%，這說明清醬肉多肽具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。清醬肉多肽中酸性氨基酸和堿性氨基酸的含量分別占總氨基酸含量的31.58%和24.78%，疏水性氨基酸含量豐富，占總氨基酸含量的31.39%，這3 類具有抗氧化作用的氨基酸占總氨基酸含量的87.75%。結(jié)合體外抗氧化活性和氨基酸組成分析，清醬肉多肽中疏水性氨基酸的含量相對(duì)較高，這有利于清醬肉多肽中一些疏水性較強(qiáng)肽段的形成，故其表現(xiàn)出較好的DPPH自由基清除能力。此外，肽段所表現(xiàn)出的較強(qiáng)·OH清除能力可能與疏水性氨基酸和酸性氨基酸（如Glu）有關(guān)。由于多肽中酸性氨基酸和中性氨基酸的存在，其側(cè)鏈含有的氨基和羧基可以與Fe2+螯合，進(jìn)而起到抑制金屬離子產(chǎn)生自由基的作用。清醬肉多肽肽段中的酸性氨基酸和堿性氨基酸可以作為供氫體和金屬離子螯合劑，故有助于其還原能力的發(fā)揮[7]。因此，可以推斷清醬肉多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性與其氨基酸組成密切相關(guān)，但是由于多肽的抗氧化性由氨基酸組成及其序列等因素共同決定，因此清醬肉多肽中生物活性肽的結(jié)構(gòu)解析還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

從清醬肉中提取并通過超濾分離得到清醬肉多肽（<10 kDa），通過4 種體外抗氧化實(shí)驗(yàn)對(duì)其自由基清除能力、Fe2+螯合能力和還原能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過氨基酸組成分析其與抗氧化活性的關(guān)系。結(jié)果表明，從清醬肉中提取到的多肽類物質(zhì)具有一定的抗氧化活性，其抗氧化能力隨著多肽質(zhì)量濃度的增大而提高，并具有一定的還原能力。此外，對(duì)清醬肉多肽進(jìn)行氨基酸組成分析，確定其氨基酸組成，結(jié)果表明，與抗氧化活性有關(guān)的疏水性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸占氨基酸總量的87.75%，清醬肉的抗氧化能力與其氨基酸組成有關(guān)，并且清醬肉多肽還具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由于肽的抗氧化能力受分子質(zhì)量、氨基酸組成、序列結(jié)構(gòu)和疏水性等多種因素影響，故對(duì)清醬肉中活性肽的分離及鑒定還需進(jìn)一步研究。

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