山銀花綠原酸提取工藝的優(yōu)化及不同時(shí)期綠原酸的含量

趙佳利，張曉娜，黃 娟，鄧 嬌

(貴州師范大學(xué) 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550001)

山銀花為忍冬科植物紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMip.)、灰氈毛忍冬(L.macranthoidesHand.-Mazz.)、華南忍冬(L.confusaDC.)和黃褐毛忍冬(L.fulvotomentosaHsu et S. C. Cheng)的干燥花蕾或帶初開的花[1]。山銀花是一種植物類抗生素藥材，是國(guó)家重點(diǎn)發(fā)展的名貴中藥材，為“銀翹片”中成藥的主要原料。山銀花主要含有綠原酸、三萜類和黃酮類化合物[2]，廣泛作為食用、藥用及化妝、保健品生產(chǎn)原材料，在我國(guó)具有很大的市場(chǎng)潛力，故有廣闊的種植前景。作為山銀花主要有效成分的綠原酸，與該植物的藥用價(jià)值和臨床療效緊密相關(guān)[3]。目前，綠原酸的含量是評(píng)價(jià)山銀花質(zhì)量的重要指標(biāo)，我國(guó)藥典明確規(guī)定山銀花干燥品綠原酸含量不得低于2%，含灰氈毛忍冬皂普乙和川續(xù)斷皂普乙的總量不得低于5%[1]。

山銀花從出花蕾至剛開花的階段可分為幼蕾期、青花期、大白期和銀花期4個(gè)階段[4]。山銀花新藤莖頂部1～3位完全伸展葉為幼葉；藤莖中下部為其成熟葉，葉片呈深綠色。

童紅等[5]對(duì)山銀花產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀調(diào)查的結(jié)果表明，近幾年全國(guó)山銀花的市場(chǎng)需求逐年增加，山銀花生產(chǎn)量和需求量難以平衡，造成供不應(yīng)求的現(xiàn)象。張永清等[6]研究發(fā)現(xiàn)，忍冬各部位以花的綠原酸含量最高，葉的其次；8～9月葉中綠原酸含量最高，同一生長(zhǎng)期葉的綠原酸含量約為花的60%～70%。武雪芬等[7]研究發(fā)現(xiàn)，越冬老葉的綠原酸含量約為花的1.41倍。葉片作為生產(chǎn)山銀花的副產(chǎn)品，在山銀花種植、修剪過(guò)程中可大量得到，但長(zhǎng)期以來(lái)并未引起足夠重視，造成了極大的資源浪費(fèi)[8]。綠原酸市場(chǎng)需求量逐年增加，提取綠原酸市場(chǎng)前景廣闊、發(fā)展?jié)摿薮骩9]。試驗(yàn)利用超聲波提取新鮮山銀花的花及葉片綠原酸的含量并了解其動(dòng)態(tài)變化，旨在為山銀花藥材規(guī)范化栽培和采收提供理論依據(jù)，為合理評(píng)價(jià)山銀花的質(zhì)量以及進(jìn)一步促進(jìn)山銀花資源的綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為中藥材山銀花的發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 山銀花 以山銀花處于幼蕾期、青色期、大白期、銀花期的花和幼葉、成熟葉的葉片新鮮樣品為研究對(duì)象。該試驗(yàn)材料于2018年5月中旬采摘于貴州省黔西南布衣族苗族自治州貞豐縣北盤江鎮(zhèn)(東徑105°64′，北緯25°64′)。

注：1，幼蕾期；2，青色期；3，大白期；4，銀花期；5，幼葉；6，成熟葉。

Note:1, young bud stage; 2, cyan period; 3, green-white stage; 4, silver florescence stage；5, young leaf; 6, mature leaf.

圖1 試驗(yàn)用各時(shí)期山銀花新鮮的花和葉

Fig.1 Fresh flowers and leaves ofLoniceraeused in the experiment at various stages

1.1.2 儀器 AR1140電子天平，上海精天電子儀器公司；微量移液器，Eppendorf(德國(guó))；DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器設(shè)備廠；H-1650R離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KS-5200DE液晶超聲波器，昆山潔力美超聲儀器有限公司；WH-861渦旋混合器，上?？等A生化儀器制造廠。

1.1.3 試劑 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度級(jí)別≥98%；無(wú)水乙醇，市售；研究過(guò)程用水均為超純水，自制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 1)樣品采集與處理。試驗(yàn)材料采摘后立即用液氮速凍，再用研缽研磨成粉末狀，存于-80 ℃冰箱備用。2)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液配制。精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于10 mL容量瓶，加入無(wú)水乙醇溶液定容至10 mL，搖勻得1 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液。使用時(shí)用移液器精密吸取1 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液1 mL于試管中，再加無(wú)水乙醇至20 mL，搖勻即得0.05 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取0.05 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL置于10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度(10 mL)，依次編號(hào)為1～7；以1號(hào)試劑溶液做參比，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于329 nm處測(cè)定各濃度綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度；以吸光度A為縱坐標(biāo)，以綠原酸濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得到線性回歸方程。

1.2.3 樣品綠原酸的提取 根據(jù)劉欣等[10-11]的研究結(jié)果，選取影響山銀花中綠原酸提取率的浸提時(shí)間、浸提液濃度和料液比等3個(gè)因素，以綠原酸提取率為評(píng)估價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)[12]進(jìn)行綠原酸超聲波浸提正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)(表1和表2)。精確稱取山銀花幼葉粉末共9份各0.5 g，分別放入50 mL離心管中并編號(hào)1～9；根據(jù)設(shè)計(jì)方案的料液比用移液器向各離心管中加入相應(yīng)體積和濃度的乙醇溶液，渦旋混勻后再進(jìn)行超聲提取，超聲頻率40 kHz，功率100 W，溫度為25 ℃；10 min、20 min和30 min后取出對(duì)應(yīng)編號(hào)的離心管，將其放入離心機(jī)中，12 000 r/min離心10 min后取上清液至另一新的50 mL離心管中(對(duì)應(yīng)編號(hào))，然后用對(duì)應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至相應(yīng)的體積；將綠原酸提取液放入-4 ℃冰箱中冷藏待用。不同發(fā)育時(shí)期花和葉中的綠原酸按照正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的優(yōu)化提取方法進(jìn)行提取，3次重復(fù)。吸取綠原酸提取液各0.5 mL分別置于25 mL容量瓶中，再用各對(duì)應(yīng)濃度的乙醇定容至刻度；然后吸取稀釋后的綠原酸提取液以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液做對(duì)照，在329 nm處測(cè)定吸光度，然后計(jì)算各樣品的綠原酸提取率。

表1 山銀花中綠原酸浸提正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal design for extraction of chlorogenic acid fromLonicerae

水平Level因素 FactorA料液比/(g∶mL)B浸提時(shí)間/minC浸提液濃度/%11∶20107521∶30208531∶403095

表2 綠原酸浸提正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案

Table 2 Design scheme of orthogonal test for extraction of chlorogenic acid

處理 TreatmentABC111121223133421252236231731383219332

1.2.4 最優(yōu)法提取各樣品的綠原酸 采用正交試驗(yàn)確定的山銀花浸提最優(yōu)條件提取不同時(shí)期花和葉中的綠原酸，3次重復(fù)。采用1.2.3的方法測(cè)定吸光度并計(jì)算綠原酸的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線 從圖2可知，綠原酸濃度在0～0.015 0 mg/mL時(shí)，其與吸光度之間存在線性關(guān)系，線性回歸方程為y=69.043x-0.015 7(R2=0.998 4)。表明，線性關(guān)系良好。

圖2 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.2 Standard curve of chlorogenic acid

2.1.2 山銀花綠原酸的浸提效果 L9(34)正交試驗(yàn)山銀花幼葉綠原酸的提取率依次為0.602%、0.459%、0.274%、0.486%、0.393%、0.641%、0.342%、1.042%和0.721%。由表3和圖3可知，各因素對(duì)山銀花中綠原酸提取率的影響程度依次為C>A>B，即浸提液濃度的影響程度最為顯著，浸提時(shí)間影響程度最低。隨著料液比增大，提取率逐漸增大，說(shuō)明，提取液體積增大能促進(jìn)更多的綠原酸溶出。隨著浸提時(shí)間增加，提取率呈先升后降趨勢(shì)，原因可能是適當(dāng)延長(zhǎng)超聲提取時(shí)間可使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎完全，綠原酸更易溶于提取液中；但處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能使綠原酸結(jié)構(gòu)破壞、分解或使細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)溶出，從而降低綠原酸提取率，與宋琳琳等[13]的結(jié)論相近。隨著浸提液濃度增加，提取率隨之降低，可能是溶劑濃度過(guò)高使干擾物質(zhì)溶解，從而影響了提取率，與單磊等[14]的結(jié)果類似。根據(jù)上述分析可得綠原酸超聲波提取的最優(yōu)條件為A3B2C1，即料液比1∶40，提取時(shí)間20 min，乙醇(浸提液)濃度75 %，在此條件下山銀花幼葉綠原酸提取率為1.042%。

表3 山銀花幼葉綠原酸浸提L9(34)正交試驗(yàn)的均值與極差

Table 3 Mean value and range of L9(34) orthogonal test for extraction of chlorogenic acid fromLonicerae%

數(shù)據(jù)來(lái)源 Data sourceABCk10.4450.4770.762k20.5070.6310.555k30.7020.5450.337極差Range0.2570.1550.425

注：表中ki為因素A、B和C的第i(i=1，2，3)水平的提取率。

Note:Thekiin the table is the extraction rate at thei(i= 1,2,3) levels of the factors A, B and C.

圖3 山銀花浸提各影響因素與綠原酸提取率關(guān)系

Fig.3 Relationships of extraction rate of chlorogenic acid with factors influencing extraction ofLonicerae

2.2 不同時(shí)期花和葉中綠原酸的含量

從圖4看出，幼蕾期、青色期、大白期、銀花期的花和幼葉、成熟葉的綠原酸含量分別為9.074 mg/g鮮重、10.415 mg/g鮮重、2.033 mg/g鮮重、2.252 mg/g鮮重和2.432 mg/g鮮重、8.520 mg/g鮮重。其中，成熟葉、幼蕾期和青色期花中的綠原酸含量均較高且相近，幼葉、大白期和銀花期花的綠原酸含量相近且相對(duì)較低，可能是因?yàn)橛兹~組織尚未成熟，葉綠體合成有機(jī)物的量較少，而隨葉片發(fā)育有機(jī)物合成量增加，從而促進(jìn)了綠原酸的生成；幼蕾期和青色期的山銀花主要呈綠色，隨花蕾的發(fā)育其顏色由綠色轉(zhuǎn)為白色，在青色期后的發(fā)育過(guò)程中花蕾中葉綠體和有機(jī)物含量減少導(dǎo)致了綠原酸含量銳減。與耿世磊等[15]的研究結(jié)論相吻合。

圖4 各時(shí)期花與葉的綠原酸含量

Fig.4 Chlorogenic acid content in flowers and leaves at various stages

3 討論與結(jié)論

該研究利用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到山銀花中綠原酸的最佳提取工藝：料液比 1∶40，提取時(shí)間20 min，乙醇(浸提液)濃度75%。超聲波能將細(xì)胞壁擊碎，使其內(nèi)容物更易溶入提取液中，從而提高綠原酸的提取率；綠原酸因含有鄰二酚羥基，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，高溫及長(zhǎng)時(shí)間提取可造成綠原酸的分解，因此，要求綠原酸提取過(guò)程中溫度不能過(guò)高，75%乙醇提取過(guò)程中溫度穩(wěn)定在25℃，可保證綠原酸處于穩(wěn)定狀態(tài)利于提取，從而有效提高綠原酸的提取率且乙醇易回收。該研究結(jié)果不僅是該研究的重要前提，使觀測(cè)值綠原酸含量接近山銀花中的真實(shí)值；也為如何更有效更經(jīng)濟(jì)地提取山銀花中的綠原酸提供了方法，并為有效提高山銀花中綠原酸資源的利用率奠定了基礎(chǔ)。該優(yōu)化工藝運(yùn)行成本低，操作簡(jiǎn)便易行，對(duì)綠原酸類熱敏性物質(zhì)的提取具有重要意義。

研究結(jié)果表明，各時(shí)期山銀花平均綠原酸含量為5.944 mg/g FW，各時(shí)期葉片平均綠原酸含量為5.476 mg/g FW，山銀花的綠原酸平均含量略高于葉片。山銀花青色期時(shí)的綠原酸含量最高，隨著花蕾發(fā)育其綠原酸含量呈升高趨勢(shì)，至青色期達(dá)最高，而后迅速降低，在大白期其綠原酸含量已降至青色期的20%左右，隨后綠原酸含量趨于平穩(wěn)狀態(tài)。成熟葉和幼蕾期山銀花的綠原酸含量接近，幼葉綠原酸含量低于成熟葉并且與銀花期的含量相近。如果入藥過(guò)程中只追求藥材的綠原酸含量，理論上應(yīng)在山銀花的青色期及時(shí)進(jìn)行采收，以期獲得最大的藥用利用價(jià)值，并可兼顧山銀花的有效成分和產(chǎn)量。在綠原酸含量方面，山銀花葉和花之間具有相似性，說(shuō)明，山銀花的葉也極具開發(fā)利用價(jià)值，在某些方面可以用山銀花的葉代替山銀花。但是，忍冬葉的藥用價(jià)值臨床應(yīng)用較少。吳飛燕[16]對(duì)山銀花枝葉進(jìn)行獸用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的結(jié)果表明，葉作為藥材的副產(chǎn)物，和原藥材花具有相似的有效成分和藥理作用。從該研究結(jié)果可以看出，山銀花的葉在獸藥領(lǐng)域或動(dòng)物飼料領(lǐng)域存在一定的利用前景，一方面可以緩解山銀花的供需壓力，節(jié)約和有效利用山銀花資源，減少動(dòng)物用藥與人類用藥的沖突；另一方面對(duì)山銀花種植戶而言，也是增加種植山銀花收入的一種方式，種植戶積極性提高也可促進(jìn)山銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。