牛支原體病PCR檢測方法的建立及初步應用

吳位珩， 徐景峨， 余 波*， 張 濤， 余國富， 楊 莉， 馮明祥，孫啟躍， 劉 鏡， 黃 波， 楊茂生， 姜玲玲

(1.貴州省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005；2.清鎮(zhèn)市動物疫病預防控制中心，貴州 清鎮(zhèn) 551400；3.貴州省關嶺自治縣畜牧服務中心，貴州 關嶺 561300)

牛支原體是危害養(yǎng)牛業(yè)的一種主要致病性支原體，除能導致牛肺炎、乳腺炎、關節(jié)炎外，還導致眼結膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產與不孕等多種疾病[1]。1961年，美國人HALE[2]首次從患乳腺炎的牛乳中分離得到牛支原體，1976年報道其與牛呼吸系統(tǒng)疾病有關。目前，該病原在世界范圍內普遍存在。歐洲每年有25%～33%的犢牛肺炎是由牛支原體引起，相當于每年損失1.44～1.92億歐元，其中英國每年有190萬頭?；寂Ｖгw肺炎，死亡達15.7萬頭。美國每年由牛支原體導致的牛呼吸系統(tǒng)疾病和乳腺疾病所造成損失達1.40億美元，牛場感染率達70%。自2008年以來，我國大部分省(地區(qū))從外地引入肉牛，爆發(fā)了以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎疫情，多數(shù)牛在運輸?shù)侥康牡睾?～2周發(fā)病，發(fā)病率為50%～100%，病死率高達10%～50%，給我國肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失[2]。隨著我國肉牛養(yǎng)殖規(guī)模的不斷壯大，北牛南運、北繁南育，引進國外種牛日益普遍，肉牛的各種疾病也隨之而來，肉牛支原體病的發(fā)生也呈逐年上升趨勢。隨著貴州扶貧攻堅的開展，肉牛引進量不斷增大的同時也帶來了一系列流行病感染問題，而肉牛運輸綜合癥最為突出，項目組2017年1月至2018年6月，對貴州引進肉牛較多的黔西縣、大方縣、水城縣、思南縣等養(yǎng)牛場進行了流行病學調查，發(fā)現(xiàn)造成貴州省肉牛運輸綜合癥主要病因是肉牛支原體感染，嚴重的繼發(fā)巴氏桿菌感染，從而造成死亡。對此，根據(jù)牛支原體OPPD/F基因序列保守區(qū)間設計引物，建立了牛支原體PCR診斷方法，結合流行病學調查、臨床癥狀及病原菌分離鑒定，對引進和飼養(yǎng)肉牛發(fā)生疾病進行確診，同時制定出有效的預防和治療措施，為飼養(yǎng)肉牛的支原體感染快速確診和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 參考菌株 牛支原體菌株由華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院惠贈；嗜血桿菌、魏氏梭菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、結核分枝桿菌均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室提供。

1.1.2 引物 根據(jù)牛支原體OPPD/F基因序列，應用Primer 5.0基因分析軟件設計引物，擴增片段為226 bp，Genbank上的登錄號為AF130119.1。上引物序列，5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT- 3′；下引物序列，5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′。由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.1.3 生化試劑 Lab-Aid 820核酸提取Mini試劑盒(試劑條、磁棒套、緩沖液ATL、洗脫液等)、DTT試劑均購自廈門致善生物科技股份有限公司；Goldview核酸染料、蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉、EDTA、Tris-HcL、瓊脂糖、DL2000 Marker、2×Taq PCR MasterMix(10 mmol/L Tris-HcL、50 mmol/L KCL、1.5 mmol/L MgCl2、0.05 U Poymerase/μL)、去離子水均購自天根生化科技(北京)有限公司；PPLO肉湯培養(yǎng)基、PPLO固體培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；特級馬血清、酵母粉、精氨酸購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、酚紅、瓊脂粉等(國產試劑)。

1.1.4 主要儀器 核酸提取儀購自廈門百維信生物科技有限公司(Lab-Aid 820)，電子天平購自美國奧豪斯(AR2140)，高速冷凍離心機購自美國賽麥飛(SORVALL:LEGEND MICRO 21R)，pH測量儀購自梅特勒-托利多(Delta 320A/c)，梯度PCR擴增儀、電泳儀、紫外透射儀、凝膠成像儀購自德國BIOMETRA，超純水器購自臺灣艾科蒲(ATZ-10-T)，紫外分光光度計購自北京普析(TU-1810SPC)，移液器產自芬蘭，移液頭、PCR離心管產自美國。

1.2 支原體培養(yǎng)基及精氨酸溶液的配制

1.2.1 PPLO液體培養(yǎng)基 稱取葡萄糖2.5 g，PPLO肉湯粉10.5 g，酵母粉2.5 g，溶于445 mL超純水中116℃滅菌20 min后，添加馬血清50 mL，10%精氨酸5 mL，8 萬IU/mL青霉素溶液5 mL，1%酚紅溶液500 μL，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PPLO固體培養(yǎng)基 稱取葡萄糖2.5 g，PPLO肉湯粉10.5 g，酵母粉2.5 g，瓊脂粉7.5 g，溶于440 mL超純水中116℃滅菌20 min后，馬血清50 mL，10%精氨酸10 mL，8 萬IU/mL青霉素溶液5 mL，鋪置平板，凝固后，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 10%精氨酸溶液 稱取精氨酸10 g溶于80 mL雙蒸水，攪拌至完全溶解后加水定容至100 mL，0.22 μm濾膜過濾后置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣本的采集

無菌采集疑似牛支原體肺炎病、死牛肺，或采用棉簽采集疑似牛支原體肺炎鼻涕(鼻拭子)，用冷藏箱帶到實驗室，待培養(yǎng)及提取DNA模板用。

1.4 病原菌的分離培養(yǎng)

將采集的牛肺置于平面皿中，用無菌生理鹽水沖洗，用無菌手術剪刀取中間未污染部分，研磨，致細碎；鼻拭子用1 mL生理鹽水浸潤，盡量將藥棉棒上的鼻涕清洗在試管里，棄去藥棉棒，將處理液0.45 μm濾膜過濾后接種于PPLO肉湯培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)48 h以上，培養(yǎng)基由紅變黃，轉接于PPLO固體培養(yǎng)基，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)72 h，在固體培養(yǎng)基上有針尖大小的菌落，普通光學顯微鏡下可見圓形，邊緣整齊，中央凸起的菌落。

1.5 樣本DNA的提取

1.5.1 組織樣本 DNA 取牛肺少許，采用滅菌手術剪剪碎，加入900 μL生理鹽水，反復凍融3次，然后5 000 r/min離心5 min，取700～900 μL上清液，加入蛋白酶K 20 μL，100 μL 10%SDS液，55℃水浴加熱30 min至組織消化完全，取出冷卻。取1 mL ddH2O將鼻拭子完全浸潤，盡量將鼻涕清洗在試管里，棄去棉棒，將溶液移入1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清，收集沉淀。將上述處理的組織液200 μL或沉淀放入核酸提取Mini試劑條中，提取的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 分離培養(yǎng)菌株 DNA 取培養(yǎng)菌液1 500 μL于1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清，收集沉淀。按核酸提取Mini試劑盒使用說明書操作進行，提取的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 參考菌株DNA 標準牛支原體菌株、嗜血桿菌、魏氏梭菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、結核分枝桿菌DNA模板的提取，方法同1.5.2。

1.6 牛支原體特異性片段的PCR擴增

1.6.1 反應體系 2×Taq PCR MasterMix為10 μL，支原體標準菌株DNA或樣本DNA 2 μL，上、下引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。

1.6.2 反應條件 94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。取擴增產物5 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后送寶生物工程大連有限公司測序。

1.7 PCR反應條件的優(yōu)化

對PCR反應條件，包括退火溫度(47℃、52℃、67℃)，引物濃度(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L)，Taq DNA聚合酶濃度(0.5 U、1 U、2 U)進行優(yōu)化，以確定最佳反應條件，同時以超純水作為空白對照。PCR反應體系(25 μL)，10×Taq Buffer 5 μL，dNTP mixture 4 μL；Taq DNA 聚合酶1 μL，用超純水補足至25 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度(47℃、52℃、67℃)1 min，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取7 μL PCR擴增產物于10 g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

1.8 PCR法擴增的特異性及敏感性測定

1.8.1 特異性 分別用標準牛支原體菌株、嗜血桿菌、魏氏梭菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、結核分枝桿菌DNA為模板，進行PCR擴增。

1.8.2 敏感性 采用TU-1800spc紫外可見分光光度計，OD值為260 nm，將牛支原體DNA模板稀釋100倍，進行濃度的測量。根據(jù)模板濃度(μg/μL)=A260×稀釋倍數(shù)×50/1000的方法進行計算。在進行敏感性試驗時，按10倍稀釋法對DNA模板進行稀釋后，取2 μL模板進行擴增，牛支原體標準DNA濃度依次為1 μg/μL、1×10-1μg/μL、1×10-2μg/μL、1×10-3μg/μL、1×10-4μg/μL、1×10-5μg/μL、1×10-6μg/μL、1×10-7μg/μL。

1.9 臨床樣品的檢測

對2017-2018年黔西縣、大方縣、水城縣、思南縣等養(yǎng)牛場采集121份樣品進行檢測，分離培養(yǎng)病原菌。

2 結果與分析

2.1 PCR產物的鑒定

牛肺炎支原體PCR擴增片段經膠回收、測序得到片段226 bp，與預測結果一致。表明，擴增片段為牛肺炎支原體的特異性條帶。

2.2 PCR反應條件的優(yōu)化

在25 μL反應體系中，最佳反應條件：退火溫度52℃，Taq DNA聚合酶10 μL，引物濃度20 μmol/L，采用上述條件擴增出了目的片段，片段大小為226 bp(圖1)，無非特異性片段產生。

注：M，Marker DL2000；1，陰性對照；2，標準陽性；3，被檢出的陽性樣本。

Note:M,Marker DL2000; 1，negative control; 2，standard positive; 3,positive samples detected.

圖1 牛支原體 PCR反應圖譜

Fig.1 Map ofM.bovinaPCR reaction

2.3 特異性及敏感性

2.3.1 特異性 由圖2可見，除牛支原體出現(xiàn)擴增帶外，其他的菌株未見特異性226 bp片段，表明引物具有特異性。

注：M，Marker DL2000；1，標準陽性；2，陰性對照；3，嗜血桿菌；4，魏氏梭菌；5，大腸桿菌；6，多殺性巴氏桿菌；7，沙門氏菌；8，牛結核分枝桿菌。

Note:M,Marker DL2000; 1,standard positive; 2,negative control; 3.Haemophilusinfluenza; 4,Clostridiumwilfordii; 5,Escherichiacoli; 6,Pasteurellamultocida; 7,Salmonella; 8,M.bovina.

圖2 牛支原體PCR特異性試驗圖譜

Fig.2 Map of the PCR specificity test ofM.bovina

2.3.2 敏感性 經測牛支原體標準DNA模板的平均OD260值為0.633 nm，試驗提取的牛支原體標準DNA模板的含量為0.5 μg/μL。由圖3可見，在PCR反應中，可檢出的牛支原體標準DNA模板的含量最小是1×10-7μg，即靈敏度為1×10-7μg。

2.4 臨床樣品的檢測

經檢測共得陽性樣本43份，且與細菌學檢驗結果一致，同時將PCR擴增片段經膠回收、測序表明，擴增片段為牛支原體的特異性條帶(圖4)。整個檢測過程僅需3.5 h。

注：M，Marker DL2000；1，陰性對照；2～8，牛支原體 DNA稀釋度分別為10-1～10-7。

Note:M,Marker DL2000; 1,Negative control; 2-8,the dilution ofM.bovinaDNA was 10-1-10-7,respectively.

圖3 牛支原體PCR敏感性試驗圖譜

Fig.3 Map of the PCR sensitivity test ofM.bovina

注：M，Marker DL2000；1，陰性對照；2，標準陽性；3～22，臨床樣本鼻拭子。

Note:M,Marker DL2000; 1,negative control; 2,standard positive; 3-22,nasal swabs from clinical samples.

圖4 臨床樣本的檢測圖譜

Fig.4 Test Map of clinical samples

3 結論與討論

目前，用于牛支原體診斷方法很多，如分離培養(yǎng)法、免疫學方法和核酸診斷技術等[3]。在標本中分離培養(yǎng)支原體，對于牛支原體感染的診斷有決定性意義，結合生化鑒定技術，可作為實驗室診斷牛支原體感染的基本診斷技術，但不能作為確定感染的最終檢測方法和結果。而大多數(shù)的肉牛支原體病伴有多病原混合感染，臨床上難以及時鑒別診斷，細菌學培養(yǎng)分離鑒定，程序繁瑣、培養(yǎng)周期長，免疫學診斷雖操作簡單，但具有抗體依耐性，特別是在感染早期，血清中抗體水平低，檢測的敏感性低，達不到早期診斷的目的，延誤防治時機，給肉牛業(yè)造成巨大的經濟損失。而PCR診斷技術具有敏感、特異的特點，能快速、準確地檢測病原核酸，且不考慮菌體死活、抗體產生等因素，并可對疾病早期進行診斷，為防治該病爭取到最佳的治療時機。因此，核酸診斷技術是牛支原體感染較為理想的診斷方法。ATP結合蛋白OPPD/F基因和DNA聚合酶Ⅲ基因為目標基因的PCR，已證實能夠較好地區(qū)別牛支原體與牛無乳支原體的感染[4]。本試驗根據(jù)牛支原體OPPD/F基因序列保守區(qū)間設計引物，通過優(yōu)化反應條件，建立了牛支原體PCR診斷方法，靈敏度為1×10-7μg，整個檢測過程僅需3.5 h。由此可見，該檢測方法具有快速、靈敏性高、特異性強等特點，對牛支原體感染的診斷、防治與預后評估具有重要意義。

經調查，貴州省肉牛運輸綜合癥主要病因是肉牛支原體感染，肉牛支原體感染的治療方法：肌肉注射治療支原體病的特效藥泰樂菌素，同時補充多種維生素及10%葡萄糖。若出現(xiàn)混合感染多種病原現(xiàn)象，治療時采用四環(huán)素、慶大霉素、地塞米松合并用藥，同時補充10%葡萄糖和維生素C，用藥5～7 d。

引進和飼養(yǎng)肉牛應注意的事項：

1)嚴格引進新牛。不從疫區(qū)或發(fā)病區(qū)引進牛。牛群引進前要作好牛布魯氏病、口蹄疫、牛結核、牛支原體、牛焦蟲病的檢疫檢測，防止引進病牛和潛伏感染期的帶菌牛。牛群起運前，要飼喂適量的水、料、草，適宜控制在八成飽，裝車前運輸車輛及上車臺等用具進行消毒，裝車避免擁擠，運輸要勻速。到達目的地后必須進行充分休息，之后方可喂水(飼喂水清潔干凈，加入電解多維和食鹽，可適量補充葡萄糖)，接著飼喂足夠的青綠飼草。對牛場新進來的牛進行監(jiān)控和隔離，包括犢牛都必須隔離，確保無病后方可與健康牛混群。

2)加強飼養(yǎng)管理。保證良好的衛(wèi)生環(huán)境非常重要，牛舍保持干燥、清潔、通風良好，注意防寒保暖，定期對肉牛場的設施設備進行清潔。定期進行消毒，控制飼養(yǎng)密度適宜，防止過于擁擠。不同來源以及不同年齡的肉牛要采取分欄飼養(yǎng)。飼喂品質優(yōu)良的飼料，補充適量的精料、微量元素和維生素，確保日糧含有全面、均衡的營養(yǎng)，增強機體抵抗力。

3)加強疾病預防。定期消毒牛舍，及時發(fā)現(xiàn)和隔離病牛，做到早診斷，早治療，同時研制并開發(fā)獸用中藥防控該病的發(fā)生和流行，以確保貴州省養(yǎng)牛業(yè)的健康和穩(wěn)定發(fā)展。