刺梨的化學(xué)成分鑒定及其抗菌活性

梁夢(mèng)琳， 李 清， 龍勇兵， 李 陽(yáng)， 李 萍， 袁小紅

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 四川 綿陽(yáng) 621000)

刺梨(RosaroxbunghiiTratt)又名繅絲花、文先果、送春歸，是薔薇科薔薇屬多年生落葉灌木[1]，為中國(guó)云貴高原特有的野生資源。刺梨具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含維生素C、黃酮、三萜、有機(jī)酸、多糖、多酚等物質(zhì)[2-6]，其中維生素C含量居水果之首[4]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)常把刺梨用于消食健胃、止瀉、維生素C缺乏癥等[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，刺梨汁能減輕拘束負(fù)荷誘發(fā)自由基對(duì)肝組織的損傷，改善肝組織機(jī)能[8]；刺梨提取物能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[9-10]；刺梨凍干粉能夠明顯減輕單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型大鼠腎功能的損害，以及輸尿管梗阻導(dǎo)致的腎纖維化[11]；刺梨汁在改善動(dòng)脈粥樣硬化方面亦有明顯作用[12]。此外，刺梨還具有抗炎、增強(qiáng)免疫、延緩衰老、降低機(jī)體內(nèi)重金屬負(fù)荷等作用[13-14]。

近年來(lái)，刺梨已成為國(guó)內(nèi)飲料、營(yíng)養(yǎng)保健品產(chǎn)業(yè)的一種重要原料，其廣泛的藥食兩用價(jià)值日益受到關(guān)注。但目前對(duì)刺梨的研究，大多集中在粗提物效果的評(píng)價(jià)，很多有效成分未得到充分的研究和利用，難以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。為此，筆者對(duì)刺梨活性成分進(jìn)行分離鑒定，并測(cè)定其抗菌活性，進(jìn)一步闡明刺梨能夠發(fā)揮一些生物活性的物質(zhì)作用基礎(chǔ)，為刺梨資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 新鮮刺梨與菌株

新鮮刺梨，購(gòu)自貴州六盤(pán)水。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteritidis)，均由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與試劑

XJ-2小型提取濃縮機(jī)組(天津大明制藥設(shè)備廠)，F(xiàn)innigan LCQDECA質(zhì)譜儀(美國(guó)阿美特克公司)，Bruker Avance-600 核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司)，制備高效液相色譜儀(江蘇漢邦公司)，制備柱(C-18柱，250 mm×10.0 mm，5 μm，Servo公司)，中壓制備色譜儀(瑞士BUCHI公司)，柱層層析硅膠(200～300目)、聚酰胺柱層析(60～90目)、薄層層析硅膠板(青島海洋化工有限公司)，SephadexLH-20 葡聚糖凝膠(瑞士Pharmacia 公司)，β-谷甾醇對(duì)照品(成都瑞芬思生物科技有限公司)，試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 刺梨提取液分離鑒定

取新鮮刺梨150 kg，用等體積70%乙醇(12 h，4次)提取，提取液濃縮成浸膏13 kg?？偨嘤盟♂尯笤儆靡宜嵋阴ポ腿?次，萃取液合并，減壓濃縮，得乙酸乙酯部分700 g。乙酸乙酯部分過(guò)聚酰胺柱層析，二氯甲烷-乙醇(2∶1、1∶1、0∶1)梯度洗脫，薄層層析硅膠板點(diǎn)樣，采用紫外、硫酸香草醛顯色等方法觀察檢測(cè)流分，合并相似流分，得到Fr.1和Fr.2。Fr.1通過(guò)柱層層析硅膠，二氯甲烷-乙醇(100∶0、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶100)梯度洗脫，薄層層析硅膠板點(diǎn)樣合并后得到5個(gè)組分(Fr1.1～Fr1.5)。取部分Fr1.2組分通過(guò)反復(fù)柱層層析硅膠以及高效液相制備色譜得到化合物1(1 g，制備條件：甲醇-水為60∶40，流速為3.0 mL/min)，化合物2(16 mg，制備條件：甲醇-水為80∶20，流速為 3.5 mL/min)，化合物7(500 mg，重結(jié)晶)。取部分Fr1.5組分過(guò)中壓反相柱層析(條件：甲醇-水為60∶40，流速為10.0 mL/min)以及制備色譜(條件：甲醇-水為65∶35，流速為2.0 mL/min)得到化合物3(18 mg)、化合物4(240 mg)、化合物5(27 mg)和化合物6(13 mg)。

1.4 抗菌活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]的方法并加以改進(jìn)，配制終濃度為108cfu/mL的菌懸液，采用刃天青96孔板微量稀釋法，對(duì)3～6號(hào)化合物進(jìn)行大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌抑菌試驗(yàn)。檢測(cè)前，分別將供試化合物和硫酸新霉素溶于二甲基亞砜(DMSO)中，制成濃度1.0 mg/mL。以硫酸新霉素為陽(yáng)性對(duì)照，并以刃天青溶液(100 μg/mL)為指示劑。在96孔板第11列每孔中加100 μL刃天青溶液。將刃天青溶液7.5 mL和5 mL菌懸液(108cfu/mL)混勻，轉(zhuǎn)移混合液100 μL到96孔板其余孔中。轉(zhuǎn)移待測(cè)化合物溶液 100 μL 到其中一行的第1個(gè)孔中，混勻后從此孔轉(zhuǎn)移100 μL到同一行的第2個(gè)孔中，混勻后再?gòu)牡?個(gè)孔轉(zhuǎn)移100 μL 到第3個(gè)孔中，以此類(lèi)推直至第10個(gè)孔為止，第10個(gè)孔的液體混勻后抽取100 μL扔掉，使每孔濃度均為前一孔的一半，第11孔為陽(yáng)性對(duì)照。最后將96孔板在37℃下培養(yǎng)5 h，有活性的標(biāo)志為從藍(lán)色到粉紅色；發(fā)生顏色變化的最低稀釋濃度即為待測(cè)化合物的最低抑菌濃度(MIC)，3次獨(dú)立試驗(yàn)的MIC值作為最終MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

在貴州剌梨中共鑒定出7種化合物，其具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

2.1.1 化合物1白色針狀結(jié)晶1H-NMR(600 MHz，CD3OD):δ5.29(1H，t，J=3.4 Hz，H-12)，3.93(1H，m，H-3)，3.33(1H，d，J=2.5 Hz，H-2)，2.51(1H，s，H-18)，1.35(3H，s，CH3-27)，1.28(3H，s，CH3-29)，1.19(3H，s，CH3-25)，0.99(6H，s，CH3-23)，0.93(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-30)，0.87(3H，s，CH3-26)，0.79(3H，s，CH3-24)，13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ42.4(C-1)，67.1(C-2)，80.1(C-3)，41.2(C-4)，49.2(C-5)，24.6(C-6)，34.1(C-7)，39.3(C-8)，49.0(C-9)，39.4(C-10)，27.2(C-11)，129.3(C-12)，140.1(C-13)，42.7(C-14)，29.5(C-15)，26.6(C-16)，48.1(C-17)，55.1(C-18)，73.6(C-19)，43.0(C-20)，19.2(C-21)，39.0(C-22)，29.2(C-23)，22.4(C-24)，17.5(C-25)，16.6(C-26)，27.1(C-27)，182.5(C-28)，24.9(C-29)，16.8(C-30)。對(duì)照文獻(xiàn)[16]的數(shù)據(jù)，確定化合物為薔薇酸(Euscaphic acid)。

2.1.2 化合物2白色粉末1H-NMR(600 MHz，CD3OD):δ5.28(1H，s，H-12)，3.65(1H，dd，J=9.6，3.0 Hz，H-2)，3.46(1H，d，J=9.6 Hz，H-1)，3.40(1H，d，J=3.0 Hz，H-3)，2.00(1H，dd，J=11.0，6.7 Hz，H-9)，1.35(3H，s，CH3-27)，1.20(3H，s，CH3-23)，1.01(3H，s，CH3-25)，0.97(3H，s，CH3-29)，0.93(3H，J=6.7 Hz，CH3-30)，0.88(3H，s，CH3-24)，0.81(3H，s，CH3-26),13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ81.3(C-1)，71.8(C-2)，80.7(C-3)，42.5(C-4)，49.7(C-5)，19.4(C-6)，34.2(C-7)，41.8(C-8)，49.8(C-9)，44.4(C-10)，27.1(C-11)，130.5(C-12)，138.9(C-13)，29.7(C-14)，29.1(C-15)，26.7(C-16)，49.0(C-17)，55.0(C-18)，73.7(C-19)，43.0(C-20)，27.3(C-21)，39.0(C-22)，28.2(C-23)，22.3(C-24)，12.9(C-25)，17.8(C-26)，24.9(C-27)，178.5(C-28)，26.7(C-29)，16.6(C-30)。對(duì)照文獻(xiàn)[17]的數(shù)據(jù)，確定化合物為1α，2β，3β，19α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid。

圖1化合物1～7的結(jié)構(gòu)

2.1.3 化合物3白色粉末ESI-MS m/z 673[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD):δ5.39(1H，d，J=8.0 Hz，glcH-1)，5.36(1H，m，H-12)，1.33(3H，s，CH3-27)，1.01(6H，s，CH3-23，CH3-26)，0.97(3H，s，CH3-29)，0.96(3H，s，CH3-25)，0.89(3H，s，CH3-30)，0.76(3H，s，CH3-24)；13C-NMR(100 MHz CD3OD):δ41.3(C-1)，65.7(C-2)，78.7(C-3)，38.1(C-4)，48.2(C-5)，17.9(C-6)，31.9(C-7)，39.7(C-8)，47.4(C-9)，38.1(C-10)，23.5(C-11)，123.5(C-12)，143.0(C-13)，41.0(C-14)，27.8(C-15)，27.0(C-16)，45.7(C-17)，43.7(C-18)，81.1(C-19)，34.5(C-20)，28.0(C-21)，32.4(C-22)，28.1(C-23)，20.9(C-24)，15.4(C-25)，16.4(C-26)，23.7(C-27)，177.2(C-28)，27.2(C-29)，23.7(C-30)，94.4(C-1’)，72.5(C-2’)，76.9(C-3’)，69.7(C-4’)，77.3(C-5’)，61.0(C-6’)。對(duì)照文獻(xiàn)[18]的數(shù)據(jù)，確定化合物為2α，3α，19α-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranoside。

2.1.4 化合物4白色針狀結(jié)晶ESI-MS m/z 673[M+Na]+;1H-NMR(400 MHz，CD3OD):δ5.35(1H，d，J=2.9 Hz，glc H-1)，5.34(1H，m，H-12)，2.54(1H，s，H-18)，1.31(3H，s，CH3-27)，1.27(3H，s，CH3-29)，1.02(3H，s，CH3-25)，1.01(3H，s，CH3-23)，0.95(3H，s，CH3-30)，0.89(3H，s，CH3-26)，0.79(3H，s，CH3-24)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ41.2(C-1)，65.8(C-2)，78.7(C-3)，37.9(C-4)，48.1(C-5)，21.1(C-6)，32.6(C-7)，40.0(C-8)，46.8(C-9)，38.1(C-10)，23.4(C-11)，128.2(C-12)，138.3(C-13)，41.5(C-14)，28.2(C-15)，25.1(C-16)，45.7(C-17)，53.6(C-18)，72.3(C-19)，41.4(C-20)，25.8(C-21)，36.9(C-22)，27.8(C-23)，17.9(C-24)，16.3(C-25)，15.5(C-26)，23.3(C-27)，177.1(C-28)，25.7(C-29)，15.2(C-30)，94.4(C-1’)，72.5(C-2’)，77.2(C-3’)，69.7(C-4’)，76.9(C-5’)，61.0(C-6’)。對(duì)照文獻(xiàn)[19]的數(shù)據(jù)，確定化合物為刺梨苷(kaiiichigeside F1)。

2.1.5 化合物5白色針狀結(jié)晶ESI-MS m/z 673[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD):δ5.11(1H，d，J=2.9 Hz，glc H-1)，5.10(1H，m，H-12)，2.30(1H，s，H-18)，1.10(6H，s，CH3-27，CH3-29)，0.79(6H，s，CH3-23，CH3-25)，0.71(3H，s，CH3-30)，0.59(3H，s，CH3-26)，0.56(3H，s，CH3-24)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ47.9(C-1)，68.1(C-2)，83.1(C-3)，37.8(C-4)，55.3(C-5)，18.3(C-6)，32.7(C-7)，39.9(C-8)，47.3(C-9)，39.1(C-10)，23.3(C-11)，128.1(C-12)，138.3(C-13)，41.3(C-14)，28.3(C-15)，25.1(C-16)，46.8(C-17)，53.6(C-18)，72.5(C-19)，41.5(C-20)，25.8(C-21)，36.9(C-22)，27.9(C-23)，16.3(C-24)，16.1(C-25)，15.8(C-26)，23.4(C-27)，177.1(C-28)，25.7(C-29)，15.2(C-30)，94.4(C-1’)，72.3(C-2’)，77.2(C-3’)，69.7(C-4’)，76.9(C-5’)，61.0(C-6’)。對(duì)照文獻(xiàn)[19]的數(shù)據(jù)，確定化合物為野薔薇苷(Rosamultin)。

2.1.6 化合物6白色粉末ESI-MS m/z 671[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD):δ5.48(1H，d，J=8.0 Hz，glc H-1)，5.34(1H，m，H-12)，1.41(3H，s，CH3-27)，1.21(3H，s，CH3-29)，1.20(3H，s，CH3-26)，0.91(3H，s，CH3-30)，0.80(3H，s，CH3-25)，0.74(3H，s，CH3-24);13C-NMR(100 MHz，CD3OD):δ53.5(C-1)，211.3(C-2)，82.5(C-3)，43.2(C-4)，53.1(C-5)，15.8(C-6)，32.4(C-7)，40.2(C-8)，46.9(C-9)，45.1(C-10)，23.2(C-11)，127.5(C-12)，138.5(C-13)，41.5(C-14)，28.3(C-15)，25.1(C-16)，48.1(C-17)，54.4(C-18)，72.2(C-19)，41.4(C-20)，25.6(C-21)，36.8(C-22)，28.1(C-23)，18.5(C-24)，15.3(C-25)，15.7(C-26)，23.2(C-27)，177.5(C-28)，25.8(C-29)，15.1(C-30)，94.4(C-1’)，72.5(C-2’)，77.2(C-3’)，69.7(C-4’)，76.9(C-5’)，61.0(C-6’)。對(duì)照文獻(xiàn)[20]的數(shù)據(jù)，確定化合物為potentilanoside B。

2.1.7 化合物7無(wú)色針狀結(jié)晶，易溶于氯仿，熔點(diǎn)(mp)溫度138～140℃，與β-谷甾醇對(duì)照品比較，發(fā)現(xiàn)兩者在薄層硅膠板上的比移值(Rf值)以及顯色情況均相同，混合后熔點(diǎn)未下降，故鑒定為β-谷甾醇。

2.2 抗菌活性

從表1可知，化合物3～6對(duì)銅綠假單胞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌均有一定的抑菌能力，化合物4對(duì)大腸桿菌的抑制作用最為明顯，最低抑菌濃度為31.3 μg/mL；4種化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別均為62.5 μg/mL和125 μg/mL；對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抑制作用以化合物3最強(qiáng)，最低抑菌濃度為62.5 μg/mL。

表1 化合物3～6的最低抑菌濃度

3 小結(jié)

研究結(jié)果表明，貴州新鮮刺梨中含有6種三萜類(lèi)化合物：薔薇酸(Euscaphic acid，化合物1)、1α，2β，3β，19α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid(化合物2)、2α，3α，19α-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid28-O-β-D-glucopyranoside(化合物3)、刺梨苷( kaiiichigeside F1，化合物4)、野薔薇苷(Rosamultin，化合物5)、potentilanoside B(化合物6)；含有1種甾醇類(lèi)：β-谷甾醇(化合物7)。其中，化合物2、化合物6為首次從刺梨中分離得到。比較化合物3～6的抗菌活性發(fā)現(xiàn)，化合物4抑制大腸桿菌的活性較強(qiáng)(MIC值為31.3 μg/mL)；化合物3抑制腸炎沙門(mén)氏菌的效果較其余化合物明顯；4種化合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯(MIC值均為62.5 μg/mL)。由此表明，這幾種化合物可作為潛在的天然食品防腐劑加以開(kāi)發(fā)。今后課題組將進(jìn)一步研究評(píng)價(jià)幾種化合物的抗真菌活性，以拓展其應(yīng)用途徑。

研究結(jié)果進(jìn)一步明確了刺梨的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為深入探究刺梨發(fā)揮多種藥理功效的具體有效成分、藥理機(jī)制等提供了參考依據(jù)，也為開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)、健康、綠色的刺梨系列功能產(chǎn)品提供了新的思路和方向。