甲狀腺微小乳頭狀癌術中冰凍病理診斷研究及B-raf基因檢測意義

邱 娟

甲狀腺微小乳頭狀癌是常見的甲狀腺惡性腫瘤，在甲狀腺惡性腫瘤中占比最高[1]，近年來其發(fā)病率上升趨勢明顯。甲狀腺微小乳頭狀癌具有病灶較小、發(fā)病區(qū)域隱匿及癥狀表現(xiàn)不明顯等特點[2-3]，早期易誤診與漏診，因此提高甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷準確性對提升患者的診治效果具有重要臨床意義。另外有研究提出，B-rafV600E基因的突變可能與腫瘤的侵襲性有關[4]，應用B-rafV600E基因突變檢測可提高甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷準確性，同時可利用B-rafV600E基因檢測的特異性來預測甲狀腺微小乳頭狀癌疾病的惡型性，對提高疾病的診治效果及指導手術方案的制定具有重要作用。本次研究為了對提高甲狀腺微小乳頭狀癌患者的診斷效果提供更多有效依據，對我院收治的168例甲狀腺微小乳頭狀癌患者行術中冰凍病理診斷并與石蠟切片病理結果進行對比，同時將其按照基因檢測分型進行臨床資料對比，分析B-rafV600E基因檢測意義，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2016年12月我院收治的168例甲狀腺微小乳頭狀癌患者作為研究對象，其中男性37例、女性131例，年齡26～69歲，平均年齡為(42.6±8.8)歲，病灶大小在0.15～1.3 cm之間，平均病灶大小為(0.71±0.11)cm，其中單側病灶患者112例、雙側病灶患者56例。

1.2 納入標準

所有患者均經石蠟切片病理檢查確診為甲狀腺微小乳頭狀癌并符合相關診斷標準[5]，患者術前未接受過藥物、手術及放射等治療；經常規(guī)輔助檢查未發(fā)現(xiàn)有頸部淋巴結腫大及遠處轉移征象患者；排除不符合上述標準及中途退出研究等患者，本次研究經相關醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬均知情并簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 術中冰凍病理診斷方法 將患者手術切除的新鮮甲狀腺組織作為標本，對其行間隔書頁狀平行切開[6]，間隔距離0.2 cm，由專業(yè)診斷醫(yī)生對標本進行詳細觀察，發(fā)現(xiàn)異常后可使用指腹行觸摸檢查，確定病灶后對病灶行最大面取材，如果病灶存在鈣化現(xiàn)象，先給予脫鈣劑處理，再行切片處理，隨后置于-22 ℃～-24 ℃冰凍切片機內，固定染色后使用重型樹膠封片，并進行光鏡檢查。

1.3.2 B-rafV600E基因檢測方法 取患者10～25 mg病灶標本，剪碎后置于1.5 ml離心管中，加入180 μl Buffer ATL、20 μl 蛋白酶K后充分混勻，隨后將離心管置于56 ℃下進行震動消化過夜。第2天將震動消化過夜的離心管進行漩渦處理，隨后將混合液置入收集柱中并加入200 μl Buffer AL、200 μl乙醇充分混勻，隨后進行1 min離心處理，完成后將混合液移入2 ml收集管中并加入500 μl Buffer AW1，行漩渦及離心處理，對處理好的混合液移入新收集管中并加入10 μl Buffer AE并置于溫室5 min，隨后在進行離心處理并重復洗脫3次。對提取成功的DNA采用美國生產的ABI7500設備及B-rafV600E基因突變檢測試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒使用說明執(zhí)行檢測操作。

1.4 判斷標準

術中冰凍病理診斷分為確診、誤診、漏診及延遲診斷4個標準[7]，其中確診為術中冰凍病理檢查出甲狀腺微小乳頭狀癌；誤診為檢查結果呈假陰性；漏診為術中冰凍病理診斷未取到病灶；延遲診斷為術中病理診斷結果疑似為甲狀腺微小乳頭狀癌、需進行石蠟切片診斷做進一步確診。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 甲狀腺微小乳頭狀癌術中應用冰凍病理診斷的檢出率

研究結果顯示，168例甲狀腺微小乳頭狀癌患者經術中冰凍病理確診138例，檢出率為82.1%；誤診15例、誤診率為8.9%；漏診8例、漏診率為4.8%；延遲診斷7例、占比4.2%。冰凍病理檢出率(82.1%)與石蠟切片病理確診率(100%)存在明顯差異，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 甲狀腺微小乳頭狀癌患者的B-raf基因結果對比

研究結果顯示，168例甲狀腺微 小乳頭狀癌患者中B-rafV600E基因為突變型有126例、野生型有42例。2種基因類型患者在腫瘤大小、是否伴有慢性淋巴性甲狀腺炎上存在明顯差異(P<0.05)；而在性別、年齡、是否有家族史、是否伴有淋巴結轉移及臨床分期上無明顯差異(P>0.05)。見表1。

3 討論

術前細針穿刺細胞學檢查及術后石蠟切片病理學檢查均被臨床認為是甲狀腺微小乳頭狀癌診斷的“黃金標準”[8]，但實踐中我們發(fā)現(xiàn)術前細針穿刺細胞學檢查仍存在假陰性的診斷結果，考慮原因是甲狀腺微小乳頭狀癌結節(jié)過小導致穿刺定位精準性受到影響，從而影響標本質量，也可能與診斷醫(yī)生的經驗不足有關，因此本次研究將術后石蠟切片病理學檢查結果作為對比對象。以上2種診斷方式效果確切，但也存在各自的局限性[9]，所以術中冰凍病理診斷這種具有檢查時間短、準確率較高的診斷方式擁有較大的應用空間[10]，由于甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷會影響術式的選擇及患者預后等，因此分析術中冰凍病理診斷甲狀腺微小乳頭狀癌的準確性具有重要臨床意義。本次研究對168例經術后石蠟切片確診為甲狀腺微小乳頭狀癌患者行術中冰凍病理診斷發(fā)現(xiàn)，168例甲狀腺微小乳頭狀癌患者經術中冰凍病理確診138例、檢出率為82.1%，提示術中冰凍病理診斷雖然無法達到石蠟切片檢查的準確性，但檢查準確性也相對較高，對甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷有一定指導意義。而對本次研究術中冰凍病理診斷的誤診、漏診進行原因分析，發(fā)現(xiàn)切片不當、溫度不當、固定不當及染色不當是造成誤診、漏診的主要原因，因此我們幾點措施以提高術中冰凍病理診斷在甲狀腺微小乳頭狀癌診斷中的準確性：①患者應完善術前各項輔助檢查，診斷醫(yī)生應對患者資料深入了解，盡可能在術前發(fā)現(xiàn)微小病灶；②取材、切片時應謹慎小心，對可疑的組織要全面檢查；③術中取材時應減少對腺體造成的破壞。

表1 甲狀腺微小乳頭狀癌患者的B-raf基因結果對比(例，%)

Raf信號通路的作用是通過將細胞表面的受體信號轉換至細胞核內[11]，從而對細胞的分化、增殖及存活等起引導作用[12]，B-rafV600E突變是最常見的基因突變[13]。臨床有研究顯示[14]，將B-raf基因檢測技術應用于穿刺組織檢查中可對評估患者預后、制定手術方案及實現(xiàn)風險評估與個體化治療等提供可靠依據，但也有學者不支持該觀點[15]，因此關于B-raf基因檢測與疾病病理因素是否存在相關性國內外學者均作了大量研究，但結果并不統(tǒng)一。本次研究結果發(fā)現(xiàn)，突變型與野生型2種基因類型患者在腫瘤大小、是否伴有慢性淋巴性甲狀腺炎上存在明顯差異，而在性別、年齡、是否有家族史、是否伴有淋巴結轉移及臨床分期上無明顯差異，因此我們認為B-rafV600E基因突變可以作為甲狀腺微小乳頭狀癌診斷的有效指標，也可以作為影響患者預后的獨立因子。

綜上所述，術中冰凍病理診斷應用于甲狀腺微小乳頭狀癌檢測中具有重要作用，且多種干預措施的應用可提高冰凍病理診斷準確率。B-rafV600E基因與甲狀腺乳頭狀癌患者的腫瘤大小及是否伴有慢性淋巴性甲狀腺炎有關，因此檢測B-rafV600E基因可為甲狀腺乳頭狀癌的防治提供更多參考依據。