細胞粘附蛋白、HER-2、ZO-1和VEGF與彌漫型胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

劉俊驥 劉 蘭 顏贊芳 張志敏

胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[1-2]。好發(fā)年齡在50歲以上，但由于飲食結(jié)構(gòu)的改變、工作壓力增大以及幽門螺桿菌的感染等原因，使得胃癌呈現(xiàn)年輕化傾向。絕大多數(shù)胃癌屬于腺癌，早期無明顯癥狀，常與胃炎、胃潰瘍等胃慢性疾病癥狀相似，易被漏診誤診，因此臨床上確診胃癌時多處于胃癌晚期，手術(shù)切除后胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移仍是胃癌患者死亡的重要原因，也是影響患者臨床治療和預后的主要因素[3-4]。細胞間黏附分子-1(ICAM-1) 和緊密連接蛋白 1(ZO-1)為機體重要的細胞活性分子，不僅可以參與調(diào)節(jié)機體免疫炎癥反應過程，而且還可介導腫瘤細胞增殖轉(zhuǎn)移和黏附作用；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和人表皮生長因子受體-2 (HER-2)主要用于促進內(nèi)皮細胞增殖、增加血管通透性，以誘導腫瘤間的血管生成[5-6]。本研究通選取2016年1月至2017年12月本院收治的胃癌患者60例，收集患者彌漫型胃癌組織、癌旁組織(距癌2 cm)和遠離胃癌的正常組織(距癌5 cm)，采用Real-Time PCR法檢測患者組織中ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA水平的表達，旨在探討ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移作用的相關(guān)性，及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象及一般資料

選取2016年1月至2017年12月本院收治的胃癌患者60例，經(jīng)組織病理學確診為彌漫型胃癌。留取患者組織學標本包括患者胃癌組織60例、癌旁組織60例(距癌2 cm)和遠離胃癌的正常組織60例(距癌5 cm)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者及家屬自愿簽署知情同意書，男性 32例，女性28例；平均發(fā)病年齡(43.29±5.76)歲。

1.2 Real-Time PCR檢測方法

采用Real-time PCR法對患者胃癌組織、癌旁組織及正常組織內(nèi)ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA表達水平進行檢測。Trizol法提取胃癌組織、癌旁組織及正常組織中的總RNA，用TaKaRa公司的Prime Script?RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒進行ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA 實時熒光定量操作。實驗采用相對定量法，采取閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold,CT)值比較法，計算不同樣本之問ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA相對百分比。公式:ΔΔCt=(CT.實驗組的基因-CT.實驗組管家基因)-(CT.對照組目的基因-CT.對照組管家基因)。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。

1.3 免疫組織化學法檢測

取胃癌患者的病理石蠟切片標本，室溫封閉40 min(5%血清)，加入單克隆抗體ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2，堿性磷酸酶二抗4 ℃孵育。PBS清洗后加入SP，和DAB恒溫顯色封片。用10×、40×物鏡顯微鏡進行觀察。ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2的主要陽性表達表現(xiàn)：棕黃色顆粒在結(jié)腸癌細胞內(nèi)出現(xiàn)。每張切片隨機選取 10 個高倍視野，記錄陽性細胞的百分率，著色細胞占計數(shù)細胞百分率≤10為陰性表達；>10為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

本實驗各組數(shù)據(jù)結(jié)果應用SPSS 22.0軟件處理，對數(shù)據(jù)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料，計量資料結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析和Bonferroni's Multiple Comparison Test。兩兩相關(guān)性分析采用相關(guān)性直線相關(guān)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Real-Time PCR檢測結(jié)果

癌旁組織和正常組織 ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA表達水平?jīng)]有顯著改變，與對照組和癌旁組織ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA表達水平相比，胃癌組患者癌組織內(nèi)ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 Real-Time PCR檢測結(jié)果

注：*為與對照組相比，P<0.05；#為與癌旁組織相比，P<0.05。

2.2 ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

免疫組織化學法結(jié)果顯示，ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2陽性表達和彌漫型胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期具有明顯的相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2陽性表達和彌漫型胃癌患者的年齡、性別和腫瘤直徑?jīng)]有相關(guān)性，差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2-3。

表2 ICAM-1、VEGF表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系/例

表3 ZO-1和HER-2表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系/例

3 討論

細胞間黏附分子-1(ICAM-1) 屬于黏附分子免疫球蛋白超家族(IgSF)成員，主要用于介導內(nèi)皮細胞間的細胞黏附、抗原遞呈功能的調(diào)節(jié)、T,B淋巴細胞的激活等免疫反應。當機體出現(xiàn)炎性反應、感染和免疫應激等情況時，ICAM-l可被過度激活和表達，參與調(diào)節(jié)機體細胞的免疫應答[7]。研究表明，高轉(zhuǎn)移的胃癌細胞中可檢測出ICAM-1高水平的表達，顯示了ICAM-1的表達與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移存在顯著的相關(guān)性，可有效用于臨床監(jiān)測胃癌的血源性淋巴性轉(zhuǎn)移[8]。緊密連接蛋白 1(ZO-1)是第1個被發(fā)現(xiàn)的緊密連接相關(guān)蛋白，在乳腺癌、胰腺癌和甲狀腺癌等侵襲性上皮性腫瘤細胞和組織中可檢測出ZO-1的迷離表達，調(diào)控上皮細胞的分化和形態(tài)，腫瘤細胞的分化和侵襲轉(zhuǎn)移，研究表明，ZO-1與腫瘤細胞的分化程度、浸潤深度、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及進展情況具有明顯的相關(guān)性[9-10]。人表皮生長因子受體-2 (HER-2)在正常人體腔上皮、 腺上皮等組織中僅僅微弱的表達，但在腫瘤細胞組織中呈過度表達，因此，檢測組織中HER-2表達對于判斷腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用，研究表明HER-2可以作為胃癌的1個不良的預后因素和治療靶點[11-12]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是1種具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞分裂原的血管內(nèi)皮細胞生成因子，在促進新血管的生成、維持血管壁的完整性和通透性等方面具有十分重要的作用[13-14]。

本研究結(jié)果表明，癌旁組織和正常組織 ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA含量沒有顯著改變，胃癌組患者癌組織內(nèi)ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA顯著升高，說明在彌漫型胃癌患者腫瘤組織中，ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2呈現(xiàn)異常高表達狀態(tài)；同時，ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2陽性表達和彌漫型胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期具有明顯的相關(guān)性，說明ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2與腫瘤細胞的分化程度、浸潤深度、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及進展情況具有明顯的相關(guān)性，在腫瘤細胞組織中呈過度表達。但ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2陽性表達和彌漫型胃癌患者的年齡、性別和腫瘤直徑?jīng)]有相關(guān)性。綜上所述，本研究結(jié)果表明ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2與彌漫型胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移存在明顯的相關(guān)性，可作為判斷胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的有效指標。