高脂環(huán)境下五指山小型豬和西藏小型豬冠心病相關(guān)血脂和炎癥易感基因的表達

郁 晨，劉志華，潘永明，徐孝平，徐劍欽，楊欽欽，蔡兆偉，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053)

冠心病(coronary artery disease, CAD)是一類嚴重的心血管系統(tǒng)疾病，發(fā)病率和死亡率高居心血管疾病之首。其主要的病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)，AS為多因素影響的復(fù)雜病變過程，是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果[1]。大量證據(jù)表明血脂異常與炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生過程中起重要作用[2-3]，因此CAD血脂和炎癥相關(guān)的易感基因的發(fā)現(xiàn)和探討成為近年研究的重點。

豬在心血管系統(tǒng)、脂蛋白代謝及消化系統(tǒng)與人類極為相似，其AS病變部位與人類AS病變的分布特點也相一致，并具有人類成熟斑塊的特點，是研究心血管疾病的一個重要模型動物。我國小型豬的品種豐富，且長期以來，由于各個豬種遺傳背景、生長環(huán)境以及所接受的飼養(yǎng)、選育方式等的不同，形成了特有的種質(zhì)特性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，五指山小型豬與西藏小型豬對高脂飼喂后的血脂代謝和炎癥反應(yīng)存在不同的敏感性[4-5]，但都易形成AS和發(fā)生CAD[6-8]。故脂質(zhì)和炎癥是誘發(fā)AS的關(guān)鍵因素，隨著近年來基因篩查和治療技術(shù)研究的不斷發(fā)展，外周血相關(guān)標記物的研究對疾病的篩查、預(yù)防和治療具有重要的指導(dǎo)意義。本研究對高脂環(huán)境下五指山小型豬和西藏小型豬的血脂和炎癥細胞變化進行觀察，并比較分析外周血白細胞中CAD相關(guān)血脂和炎癥易感基因的表達差異，以期能篩選出這兩種小型豬CAD易感基因，為五指山小型豬和西藏小型豬在代謝性心血管病中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級雄性五指山小型豬、西藏小型豬各5只，4月齡，體重10～15 kg，其中，西藏小型豬購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK (粵) 2011-0015]，五指山小型豬購自海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供[SCXK (瓊) 2014-0006]，均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心普通級小型豬實驗室[SYXK (浙) 2013-0184]，環(huán)境溫度為(22 ±1)℃，相對濕度為45%～65%，一日二次飼喂，自由飲水，12 h/12 h明暗交替。本實驗所有飼養(yǎng)、操作和護理均按照“實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南”進行，實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(ZSLL-2016-0031)。

1.2 主要試劑與儀器

全自動生化分析儀(7020，日立公司，日本)，分類血自動血液分析儀(2120型，拜耳公司，美國)，PCR儀(PTC-200， Bio-Rad公司，美國)，實時熒光定量PCR儀(iQ5， BIO-Rad公司，美國)，垂直電泳儀(SE260， GE公司，美國)，紅外熒光掃描系統(tǒng)(Odyssey，LI-COR公司，美國)。Total RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)及熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ)購自大連TAKARA公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；低密度脂蛋白受體(LDLR)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)、5脂氧合酶(5-LO)、5脂氧合酶激活蛋白(FLAP)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等抗體均購自Santa Cruz公司；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)購自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司；五分類血常規(guī)試劑包購自拜耳公司；C反應(yīng)蛋白(CRP)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELIAS測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗方法

取五指山小型豬、西藏小型豬各5只，飼喂高脂飼料(配方：10%蛋黃粉、15%起酥油、1.5%膽固醇、73.5%基礎(chǔ)飼料)，每日飼料量為體重的2.5%，分成等量的2次飼喂，每2周稱量體重后調(diào)整飼料量，連續(xù)飼喂6個月[5]。每月檢測血脂和血常規(guī)指標，并取飼喂前和飼喂6月后的靜脈血，一份取1 mL全血分離血清，采用ELISA法檢測CRP、TNF-α水平；另一份取8 mL全血分離白細胞，檢測LDLR、LPL、PCSK9、ApoAV、5-LO、FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表達。并在飼喂6個月后將小型豬處死，剖腹取腹主動脈組織，進行HE染色，觀察病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3.1 血脂和血常規(guī)指標測定

取高脂飼喂前和飼喂后每月一次檢測，檢測前禁食8 h后，從小型豬前腔靜脈取血4 mL，3000 r/min離心10 min，分離血清，在7020全自動生化分析儀測定TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，同時，取1 mL血置于EDTA-K3抗凝管中，測定血常規(guī)指標，觀察白細胞(WBC)、中性粒細胞(NEUT)和單核細胞(MONO)的變化，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.3.2 腹主動脈HE染色

將固定后的腹主動脈組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制成4 μm厚的切片，行HE染色，光鏡下觀察組織病變情況，并拍照記錄。

1.3.3 Real-time PCR法檢測外周血白細胞中血脂和炎癥相關(guān)mRNA的表達

分別取造模前和高脂飼喂6個月后的靜脈血8 mL，無菌條件下分離白細胞，用裂解液處理后放置-70℃保存，備用。采用TRIzol法提取白細胞中總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA。選取GAPDH為內(nèi)參基因，以Primer 5.0軟件設(shè)計豬相關(guān)基因的引物(見表1)。根據(jù)熒光定量試劑盒說明書進行Real-time PCR反應(yīng)，根據(jù)Ct值，通過2-△△Ct法計算各個基因的相對表達量。

1.3.4 Western blot法檢測外周血白細胞中血脂和炎癥相關(guān)蛋白的表達

在白細胞樣本中加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min得到蛋白樣品，用BCA蛋白濃度試劑盒檢測總蛋白濃度，于100℃加熱5 min使蛋白變性。取等量樣品于5%SDS-PAGE膠中電泳(80 V，40 min；120 V，2 h)后，通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶于37℃封閉2 h。按說明書比例加入一抗，4℃過夜。洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，用TBST洗滌。結(jié)果用 Odyssey 紅外熒光掃描儀檢測，計算各條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參計算各蛋白的表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清脂質(zhì)代謝的變化

與高脂飼喂前比較，高脂飼喂后五指山小型豬和西藏小型豬的血清TC、HDL-C、LDL-C水平均顯著升高(P<0.01)，其中，高脂飼喂1個月時TC、LDL-C水平達到高峰，2個月時略有回落，3個月時回升并保持在高水平狀態(tài)；高脂飼喂1個月后HDL-C水平一直穩(wěn)定在高水平狀態(tài)；五指山小型豬的TG亦有上升趨勢，但差異不明顯(P>0.05)，但西藏小型豬的TG水平與飼喂前相當(dāng)。另外，高脂飼喂前五指山小型豬和西藏小型豬的TC、LDL-C水平相當(dāng)，而在高脂飼喂1～6個月期間五指山小型豬的TC、LDL-C水平均高于西藏小型豬，但差異不顯著(P>0.05)，同時五指山小型豬的TG水平在高脂飼喂前后均高于西藏小型豬，并在高脂飼喂后1個月和3～6個月期間五指山小型豬的血清TG顯著高于西藏小型豬(P<0.05，P<0.01)(圖1)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

注：A～D：分別為各組TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的變化。與高脂飼喂前(0個月)比較，*P<0.05，**P<0.01；與西藏小型豬比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 高脂飼喂后五指山小型豬和西藏小型豬的血脂代謝的變化Note. A-D, The changes of TC, TG, HDL-C, and LDL-C levels in each group, respectively. Compared with 0 month,*P<0.05,**P<0.01. Compared with the Tibetan minipig,#P<0.05,##P<0.01.Figure 1 Changes in serum lipid metabolism in the WZS minipigs and Tibetan minipigs after high-fat diet feeding

2.2 白細胞數(shù)目、中性粒細胞和單核細胞的變化

與高脂飼喂前比較，西藏小型豬在高脂飼喂后白細胞(WBC)數(shù)目、中性細胞比率(NEUT%)、單核細胞比率(MONO%)均有不同程度的升高，其中，高脂飼喂2個月時WBC數(shù)目升高顯著并達到高峰，3個月時略有回落但仍保持在較高狀態(tài)；五指山小型豬WBC數(shù)目和NEUT%無明顯變化(P>0.05)，而MONO%在高脂飼喂后有不同程度升高，其中，在高脂飼喂后2、4、5、6個月時呈顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。另外，高脂飼喂前西藏小型豬的WBC數(shù)目與五指山小型豬相當(dāng)，而在高脂飼喂后西藏小型豬的WBC數(shù)目持續(xù)高于五指山小型豬，且在高脂飼喂后2、3、5、6個月時呈顯著性差異(P<0.05)；同時西藏小型豬的NEUT%和MONO%在高脂飼喂前后均高于五指山小型豬，其中，NEUT%在高脂飼喂后1～6個月時均呈顯著性差異(P<0.05,P<0.01)，MONO%在高脂飼喂后3、6個月時呈顯著性差異(P<0.05)(圖2)。

2.3 血清CRP、TNF-α水平比較

與高脂飼喂前比較，西藏小型豬在高脂飼喂6個月后血清CRP和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；但五指山小型豬血清CRP和TNF-α雖有上升趨勢但無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

2.4 腹主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，西藏小型豬和五指山小型豬腹主動脈血管組織均出現(xiàn)內(nèi)皮增厚、不平整，平滑肌排列紊亂，并伴有炎性細胞浸潤，大量脂質(zhì)、泡沫細胞沉積等，已形成明顯的AS斑塊(圖4)。

注：A：白細胞數(shù)目；B：中性粒細胞百分比；C：單核細胞百分比；與高脂飼喂前(0個月)比較，*P<0.05，**P<0.01；與五指山小型豬比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 高脂飼喂后五指山小型豬和西藏小型豬的白細胞數(shù)目、中性粒細胞和單核細胞的變化Note. A, Number of white blood cells. B, Percentage of neutrophils. C, Percentage of monocytes. Compared with 0 month,*P<0.05,**P<0.01. Compared with the WZS minipig,#P<0.05,##P<0.01.Figure 2 Changes in WBC, NEUT%, and MONO% of the WZS minipigs and Tibetan minipigs after high-fat diet feeding

注：A：C反應(yīng)蛋白水平(CRP)；B：腫瘤壞死因子-α水平(TNF-α)；與高脂飼喂前(0個月)比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 高脂飼喂后五指山小型豬和西藏小型豬的血清CRP和TNF-α的變化Note. A, C-reactive protein level. B, TNF-α level. Compared with 0 month,*P<0.05,**P<0.01.Figure 3 Changes in CRP and TNF-α levels of the WZS minipigs and Tibetan minipigs after high-fat diet feeding

圖4 高脂誘導(dǎo)后兩種小型豬主動脈病理形態(tài)學(xué)變化Figure 4 Pathological changes of the thoracic aorta in the two miniature pigs after high-fat induction

2.5 外周血白細胞中AS相關(guān)血脂易感基因的基因和蛋白表達

2.5.1 外周血白細胞中AS相關(guān)血脂易感基因的基因和蛋白表達

與高脂飼喂前比較，五指山小型高脂飼喂6個月后外周血白細胞中LDLR、ApoAV mRNA表達顯著降低(P<0.05，P<0.01)，而PCSK9、LPL mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.01，P<0.05)；西藏小型豬高脂飼喂6個月后外周血白細胞中LPL mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.01)，而LDLR、PCSK9、ApoAV mRNA表達無明顯變化(P>0.05)(圖5)；從圖5亦可看出，高脂飼喂6個月后，五指山小型豬外周血白細胞中PCSK9 mRNA表達上調(diào)和西藏小型豬外周血白細胞中LPL mRNA的表達上調(diào)尤為突出。

2.5.2 外周血白細胞中AS相關(guān)血脂易感基因的蛋白表達

與高脂飼喂前比較，五指山小型高脂飼喂6個月后外周血白細胞中LDLR、ApoAV蛋白表達均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，但PCSK9、LPL蛋白表達均無明顯差異(P>0.05)；西藏小型豬外周血白細胞中LPL蛋白表達顯著上升(P<0.01)，但LDLR、PCSK9、ApoAV蛋白表達均無明顯差異(P>0.05)(圖6)。

2.6 外周血白細胞中AS相關(guān)炎癥易感基因的基因和蛋白表達

2.6.1 外周血白細胞中AS相關(guān)炎癥易感基因的mRNA表達

與高脂飼喂前比較，五指山小型豬高脂飼喂6個月后外周血白細胞中5-LO、FLAP、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，MMP-9的表達有上升趨勢(P>0.05)；西藏小型豬外周血白細胞中5-LO、FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達均顯著上調(diào)(P<0.01)。另外，高脂飼喂6個月后，西藏小型豬外周血白細胞中FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達上調(diào)幅度均大于五指山小型豬，而5-LOmRNA表達則五指山小型豬高于西藏小型豬(圖7)。

2.6.2 外周血白細胞中AS相關(guān)炎癥易感基因的蛋白表達

與高脂飼喂前比較，五指山小型豬和西藏小型豬外周血白細胞中5-LO、FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達均有不同程度的上升，其中，西藏小型豬外周血白細胞中FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；而五指山小型豬外周血白細胞中5-LO蛋白表達存在顯著性差異(P<0.05)(圖8)。

注：A～D：分別為各組LDLR、PCSK9、LPL和ApoAV mRNA 表達。N和M分別表示高脂飼喂前和飼喂6個月；W、T分別表示五指山小型豬、西藏小型豬；下圖同。與高脂飼喂前比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 高脂飼喂后五指山和西藏小型豬外周血白細胞中LDLR、PSCK9、LPL、ApoAV mRNA表達變化Note. A-D, The mRNA expression levels of LDLR, PCSK9, LPL, and ApoAV in each group, respectively. N and M indicate before and 6 months after high-fat diet feeding, respectively; W and T respectively represent WZS minipigs and Tibetan minipigs; the same in the following figures. Compared with that before high-fat diet feeding,*P<0.05,**P<0.01.Figure 5 Changes in the expressions of LDLR, PSCK9, LPL, and ApoAV mRNA in the peripheral blood leukocytes of the WZS and Tibetan minipigs after high-fat diet feeding

注：A：蛋白表達代表圖；B～E：分別為各組LDLR、PCSK9、LPL、ApoAV蛋白相對表達量。與高脂飼喂前比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 高脂飼喂后五指山和西藏小型豬外周血白細胞中LDLR、PSCK9、LPL、ApoAV 蛋白表達變化Note. A, A representative presentation of protein expression. B-E, The relative expression levels of LDLR, PCSK9, LPL, and ApoAV protein, respectively. Compared with that before high-fat diet feeding, *P<0.05,**P<0.01.Figure 6 Changes in the expressions of LDLR, PSCK9, LPL, and ApoAV protein in the peripheral blood leukocytes of the WZS and Tibetan minipigs after high-fat diet feeding

注： A～ E：分別為各組5-LO、FLAP、MMP-9、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達。與高脂飼喂前比較，*P<0.05，**P<0.01。圖7 高脂飼喂后五指山和西藏小型豬外周血白細胞中5-LO、FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達變化Note. A-E, The mRNA expression levels of 5-LO, FLAP, MMP-9, ICAM-1, and VCAM-1 in each group, respectively. Compared with that before high-fat diet feeding,*P<0.05,**P<0.01.Figure 7 Changes in the expressions of 5-LO, FLAP, MMP-9, ICAM-1, and VCAM-1 mRNA in the peripheral 1blood leukocytes of WZS and Tibetan minipigs after high-fat diet feeding

注：圖A為蛋白表達代表圖，圖B-F分別為各組5-LO、FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量；與高脂飼喂前比較，*P<0.05，**P<0.01。圖8 五指山和西藏小型豬外周血白細胞中5-LO、FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達Note. A, A representative presentation of protein expression. B-F, The relative expression levels of 5-LO, FLAP, MMP-9, ICAM-1, and VCAM-1 protein, respectively. Compared with that before high-fat diet feeding,*P<0.05,**P<0.01.Figure 8 Changes in the expressions of 5-LO, FLAP, MMP-9, ICAM-1, and VCAM-1 protein in the peripheral blood leukocytes of WZS and Tibetan minipigs after high-fat diet feeding

3 討論

CAD由冠狀動脈狹窄或閉塞引起，而脂質(zhì)沉積是引起冠狀動脈狹窄的首要原因，尤其血中LDL-C過量是導(dǎo)致脂質(zhì)在血管壁沉積的危險因素。一旦血脂代謝異常，則會導(dǎo)致血中LDL-C升高，血中過量的LDL-C會滯留于損傷的血管內(nèi)皮下，并被氧化形成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，進而導(dǎo)致泡沫細胞的產(chǎn)生，促進AS發(fā)生[9]。本研究結(jié)果顯示，高脂飼喂后五指山小型豬和西藏小型豬的血清TC、HDL-C、LDL-C均顯著且成倍上升，持續(xù)穩(wěn)定在高水平狀態(tài)，表明高脂飲食的環(huán)境下五指山小型豬和西藏小型豬均發(fā)生血脂異常，且五指山小型豬的TC、LDL-C水平高于西藏小型豬，這與前期對單次靜脈注射脂肪乳和單次飼喂高脂飼喂的敏感性研究基本一致[4]，也進一步證實了五指山小型豬對高脂飲食易感且脂質(zhì)代謝的清除率相對較慢。另外，五指山小型豬在高脂飼喂后TG水平略有升高，而西藏小型豬則基本保持不變，該結(jié)果可能與小型豬的品系、飼料成分和造模時間有關(guān)，因為高脂飲食早期TG主要在肝中沉積，導(dǎo)致外周血中TG升高不明顯，其具體原因有待進一步探討。盡管血脂異常所導(dǎo)致的脂質(zhì)在血管壁沉積是AS形成的基礎(chǔ)，同樣也有大量研究提出單純的血脂異常并不會引起CAD，往往伴著不同程度的炎癥反應(yīng)，AS的形成是一個慢性的病理過程，但血脂異常誘發(fā)且加劇炎癥反應(yīng)，進而誘發(fā)CAD[10]。血中過量的LDL-C聚集于血管內(nèi)皮下，并向CAD發(fā)展是以炎癥因子、單核/巨噬細胞為基礎(chǔ)的炎癥反應(yīng)過程[11-12]。本研究結(jié)果顯示，高脂飼喂后五指山小型豬和西藏小型豬的MONO%均出現(xiàn)上升，表明在高脂環(huán)境下誘發(fā)了兩種小型豬的單核細胞聚集和活化，出現(xiàn)了慢性的低度炎癥。高脂誘導(dǎo)后西藏小型豬同時出現(xiàn)WBC和NEUT%上升，相反五指山小型豬則未見明顯變化，且西藏小型豬的WBC和NEUT%、MONO%均明顯高于五指山小型豬，另外高脂飼喂后西藏小型豬血清CRP和TNF-α水平均顯著升高，而五指山小型豬上升幅度較西藏小型豬降低，說明西藏小型豬的炎癥程度相對較高，這可解釋西藏小型豬的血脂水平雖不如五指山小型豬高，但仍易引發(fā)AS的形成[6-8]；同時本研究HE染色也顯示西藏小型豬和五指山小型豬均出現(xiàn)嚴重AS病變，說明高脂環(huán)境、氧化應(yīng)激和慢性炎癥是引起AS斑塊形成的主要原因。

CAD的主要病理基礎(chǔ)是AS，AS的發(fā)生與發(fā)展是多因素、多步驟的，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，不同個體在相同環(huán)境下，冠心病的易感性存在差異。本研究在相同的高脂飼喂環(huán)境下，觀察五指山小型豬和西藏小型豬 CAD相關(guān)血脂和炎癥易感基因的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五指山小型豬高脂飼喂6個月后外周血白細胞中LDLR、ApoAV 表達顯著降低，而PCSK9、LPL 表達顯著上調(diào)；西藏小型豬高脂飼喂6個月后LPL 表達顯著上調(diào)，而LDLR、PCSK9、ApoAV表達無明顯變化，結(jié)果也顯示，五指山小型豬高脂飼喂后PCSK9表達升高和LDLR表達降低的幅度較大，而西藏小型豬LPL表達上升的幅度較大，由此說明，高脂環(huán)境下對五指山小型豬外周血PCSK9和LDLR基因表達較為敏感，而對西藏小型豬則以LPL基因表達較為敏感。另外，LDLR缺陷或缺失，不僅可導(dǎo)致LDLR數(shù)目降低或蛋白結(jié)構(gòu)改變，影響與LDL-C的結(jié)合，而且阻止LDL-C進入細胞，導(dǎo)致血中膽固醇升高，使膽固醇在外周組織聚集，促進AS的發(fā)生[13]。而PCSK9表達升高后從細胞分泌出，降解其它細胞表面的LDLR，影響LDL-C的攝取，從而增加血漿LDL-C水平[14]。本研究結(jié)果提示，在相同的高脂環(huán)境下兩種小型豬TC、LDL-C水平的差異可能與外周血白細胞PCSK9和LDLR基因表達的差異有關(guān)。

本研究結(jié)果同時發(fā)現(xiàn)，在相同的高脂環(huán)境下，五指山小型豬和西藏小型豬外周血白細胞中5-LO、FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1表達均出現(xiàn)上調(diào)，但西藏小型豬FLAP、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1的基因表達和MMP-9、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達上調(diào)幅度大于五指山小型豬，而五指山小型豬5-LO的基因表達和5-LO、FLAP的蛋白表達則高于西藏小型豬。由此說明，高脂環(huán)境下對西藏小型豬MMP-9、ICAM-1、VCAM-1基因表達較為敏感，而對五指山小型豬是5-LO基因表達較為敏感。LO -LTs炎癥通路在AS中的扮演重要角色[15]。5-LO是催化花生四烯酸(arachidonic acid, AA)生成白三烯(leukotrienes, LTs)的關(guān)鍵酶。合成的白三烯與其特異性受體結(jié)合，激活白細胞和粘著在血管內(nèi)皮細胞層的單核細胞，增加血管通透性，促進血栓形成，參與AS的發(fā)生[16]。MMP-9與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)，在各種炎癥因子刺激下，斑塊局部巨噬、泡沫細胞大量合成分泌MMP-9，分解斑塊內(nèi)多種膠原和明膠，引起纖維帽變薄甚至破裂，導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生，且外周血MMP-9升高是AS斑塊不穩(wěn)定的重要標志[17]。ICAM-1和VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，介導(dǎo)白細胞向血管內(nèi)皮的遷移和粘附，是早期AS病變發(fā)生的關(guān)鍵因素。血清ICAM-1、VCAM-1水平增高與AS進展有關(guān)，目前已被作為檢測冠心病患者內(nèi)皮功能障礙的生物標志物[18]。本研究結(jié)果提示，在相同的高脂環(huán)境下西藏小型豬的炎癥程度高于五指山小型豬的主要原因與這些炎癥易感基因的表達差異有關(guān)。

綜上所述，在相同的高脂環(huán)境下五指山小型豬、西藏小型豬均出現(xiàn)不同程度的血脂異常和炎癥反應(yīng)，五指山小型豬血脂高于西藏小型豬，而西藏小型豬炎癥程度高于五指山小型豬，這些表癥與這兩種小型豬 CAD相關(guān)血脂和炎癥易感基因的表達差異有關(guān)，其敏感性存在異質(zhì)性，其中五指山小型豬外周血白細胞對LDLR、PCSK9、5-LO表達較為敏感，提示五指山小型豬的AS形成可能與血脂紊亂和慢性低度炎癥有關(guān)；相反，西藏小型豬外周血白細胞對LPL、MMP-9、ICAM-1及VCAM-1表達較為敏感，提示西藏小型豬AS發(fā)生進程中，血脂紊亂雖作為起始因子，但嚴重的炎癥反應(yīng)參與并貫穿于發(fā)生始末，可能是導(dǎo)致AS病變嚴重的重要原因之一。本研究為這兩種小型豬在代謝性心血管疾病中的選擇應(yīng)用提供實驗依據(jù)。