抗酸染色室間質(zhì)量評價質(zhì)控片的標(biāo)準(zhǔn)化制備及評價

張 震，郭 攀，王淑玲，顏 令，徐蘭蘭，廖 璞△

(1.重慶市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 400014；2.內(nèi)江市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川內(nèi)江 641000)

WHO宣布控制結(jié)核病最佳策略中重要的一步就是通過痰涂片顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)可疑患者[1]?？顾崛旧蚱浣?jīng)濟(jì)、方便且能快速篩查可疑結(jié)核病患者，一直以來均被發(fā)展中國家臨床醫(yī)生和實(shí)驗(yàn)室人員所青睞[2]。我國絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，包括基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室均開展了抗酸染色項(xiàng)目，但對該項(xiàng)目的準(zhǔn)確度評價仍面臨巨大的挑戰(zhàn)[3]，雖然各級臨床檢驗(yàn)中心組織有抗酸染色項(xiàng)目室間質(zhì)量評價，但目前仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化制備抗酸染色項(xiàng)目室間質(zhì)量評價質(zhì)控片的相關(guān)研究。本研究基于重慶市臨床檢驗(yàn)中心的平臺，探討了標(biāo)準(zhǔn)化制備穩(wěn)定、均一抗酸染色室間質(zhì)量評價質(zhì)控片的方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19977(CICC10381)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2儀器與試劑 血培板、改良羅氏培養(yǎng)基購自重慶旁通生物科技有限公司，革蘭染色、抗酸染色試劑購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，比濁儀購自法國梅里埃，普通光學(xué)顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司。

1.3方法

1.3.1染色方法 革蘭染色、萋-尼氏抗酸染色按商品化染色液說明書操作。

1.3.2確定最適培養(yǎng)基 從-80 ℃冰箱中取出膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株干粉，在做好個人防護(hù)的前提下于生物安全柜中用無菌肉湯1 mL溶解，溶解后用接種環(huán)挑取一環(huán)，接種于血平板上，分三區(qū)劃線，放于35 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3 d[4]。另外取50 μL接種于改良羅氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)有ATCC 19977的血平板和改良羅氏培養(yǎng)基取出，取3 mL生理鹽水，制備成3.00麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?。調(diào)整好后分別用空針抽取1 mL菌懸液注入陰性血培養(yǎng)中，搖勻，分別取10 μL在玻片上涂2 cm2大小的菌膜，玻片自然風(fēng)干，固定，進(jìn)行抗酸染色。

1.3.3確定最佳消化液、消化時間和消化溫度 (1)胰蛋白酶和N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)是消化痰液的2種良好消化劑[5]。有研究表明，使用1%胰蛋白酶消化30 min能得到理想的消化效果[6]；而NALC使用最多的濃度是2%、消化15 min[7]。因此，本研究按文獻(xiàn)報道的消化濃度和消化時間分別對胰蛋白酶和NALC的消化效果進(jìn)行了評價。在生物安全柜中分別用無菌一次性塑料吸管吸取2 mL濃痰于痰杯中，分別加1%胰蛋白酶2 mL常溫消化30 min、2% NALC 2 mL常溫消化15 min，消化完后取10 μL于玻片上涂2 cm2菌膜，分別涂4張，2張進(jìn)行革蘭染色，2張進(jìn)行抗酸染色。(2)在生物安全柜中分別用無菌一次性塑料吸管吸取1 mL濃痰于痰杯中，加入1%胰蛋白酶1 mL分別在室溫和37 ℃消化30 min，消化結(jié)束后取10 μL于玻片上涂2 cm2，分別涂4張，2張進(jìn)行革蘭染色，2張進(jìn)行抗酸染色。(3)在生物安全柜中分別用無菌一次性塑料吸管吸取1 mL濃痰于痰杯中，分別加入1%、2%、5%、10%胰蛋白酶1 mL于37 ℃消化30 min，消化完后取10 μL涂于玻片上涂2 cm2，分別涂4張，2張進(jìn)行革蘭染色，2張進(jìn)行抗酸染色。(4)根據(jù)酶動力學(xué)相關(guān)知識，當(dāng)酶濃度、底物濃度、反應(yīng)溫度、pH確定的時候，反應(yīng)速率隨即確定[8]，達(dá)到理想的消化效果，即有一個最佳的消化時間。為此，本研究設(shè)計了4種不同的消化時間。在生物安全柜中分別用無菌一次性塑料吸管吸取1 mL濃痰于痰杯中，加入2%胰蛋白酶1 mL于37 ℃分別消化10、20、30、60 min，消化完后取10 μL在干凈玻片上制成2 cm2橢圓形痰膜，分別涂4張，2張進(jìn)行革蘭染色，2張進(jìn)行抗酸染色。

1.3.4制備不同等級抗酸染色室間質(zhì)量評價質(zhì)控片 在生物安全柜中用無菌一次性塑料吸管吸取5 mL濃痰于痰杯中，加入2%胰蛋白酶5 mL，在37 ℃孵箱中消化20 min。將培養(yǎng)有膿腫分枝桿菌ATCC 19977的血平板取出，在生物安全柜中調(diào)菌懸液到0.50麥?zhǔn)蠞舛?，?00 μL菌懸液于900 μL生理鹽水稀釋10倍，再取稀釋后的菌懸液500 μL于500 μL生理鹽水中，稀釋2倍，之后再取100 μL稀釋的菌懸液加入900 μL消化的痰液，于生物安全柜中渦旋震蕩，混勻；取0.50麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?00 μL于900 μL生理鹽水中稀釋10倍，再取100 μL稀釋的菌懸液加入900 μL消化的痰液，于安全柜渦旋震蕩，混勻；取0.50麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?00 μL于900 μL生理鹽水中稀釋10倍，再取200 μL稀釋的菌懸液加入800 μL消化的痰液，于安全柜渦旋震蕩，混勻；取0.50麥?zhǔn)蠞舛认♂尩木鷳乙?00μL加入900 μL消化的痰液，于生物安全柜中渦旋震蕩混勻。各取10 μL涂于玻片上，制成2 cm2橢圓形痰膜，各濃度分別制備4張。

1.3.5穩(wěn)定性、均一性評價 (1)基于能力驗(yàn)證質(zhì)控片在發(fā)放過程中生物安全的考慮，本研究對抗酸染色質(zhì)控片進(jìn)行了滅菌處理，處理方式包括紫外線滅菌處理24 h、高壓蒸汽滅菌(121 ℃、20 min)、80 ℃高溫烘烤3 h；通過比較3種滅菌方式后膿腫分枝桿菌菌體染色形態(tài)，背景細(xì)胞形態(tài)，評價其穩(wěn)定性。對紫外線滅菌24 h的室間質(zhì)量評價質(zhì)控片在室溫放置1、2周，1、3、6個月，每個時間點(diǎn)取出室間質(zhì)量評價質(zhì)控片進(jìn)行抗酸染色，評價膿腫分枝桿菌ATCC 19977菌體形態(tài)及背景細(xì)胞形態(tài)。以鏡檢膿腫分枝桿菌菌體抗酸染色成典型的紅色桿菌、且染色結(jié)果穩(wěn)定、顯微鏡下形態(tài)完好、背景中性粒細(xì)胞胞體完整、背景清晰、呈藍(lán)色作為穩(wěn)定性評價標(biāo)準(zhǔn)。(2)在生物安全柜中隨機(jī)抽取制備好的、等級為+++室間質(zhì)量評價質(zhì)控片10張，每張進(jìn)行抗酸染色鏡檢，讀取30個油鏡視野。計數(shù)每個油鏡視野的抗酸桿菌細(xì)菌數(shù)，計算平均值，根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS 288-2017《肺結(jié)核診斷》判斷結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1血平板是最佳的培養(yǎng)基 血平板培養(yǎng)的膿腫分枝桿菌通過抗酸染色后形態(tài)呈典型的紅色長桿菌，直徑3.0～5.0 μm，鏡下容易識別(圖1)。改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的ATCC 19977菌體細(xì)小，直徑0.5～1.0 μm，形態(tài)呈細(xì)小桿菌，不易識別(圖2)。不適于抗酸染色室間質(zhì)量評價質(zhì)控片的制備。

圖2 膿腫分枝桿菌ATCC 19977在改良羅氏 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和抗酸染色鏡下形態(tài)

2.2胰蛋白酶是處理痰液最優(yōu)的消化液 使用胰蛋白酶消化后的痰液均勻，流動性強(qiáng)，抗酸染色、革蘭染色低倍鏡下均能看見膿細(xì)胞相對均勻分布，而通過NALC消化后的痰液出現(xiàn)小的絮狀痰塊，且流動性欠佳，通過革蘭染色和抗酸燃染色后在低倍鏡下觀察，NALC消化的痰液細(xì)胞呈塊狀聚集，非均勻地分散，表明消化效果不理想(圖3、4)。

圖3 濃痰在1%胰蛋白酶消化30 min后的 外觀和顯微鏡下形態(tài)

圖4 濃痰在2% NALC消化15min后的 外觀和顯微鏡下形態(tài)

2.3胰蛋白酶在37 ℃條件下消化效果優(yōu)于常溫下的消化效果 37 ℃下1%胰蛋白酶消化后痰液中的中性粒細(xì)胞呈均勻分布，而在室溫下消化后低倍鏡和高倍鏡下仍可見典型的黏液絲(圖5、6)。表明在37 ℃條件下胰蛋白酶消化效果明顯優(yōu)于室溫下消化效果。

圖5 1%胰蛋白酶常溫消化濃痰1 h，革蘭 染色、抗酸染色高倍鏡下形態(tài)

圖6 1%胰蛋白酶37 ℃消化1 h，革蘭 染色、抗酸染色高倍鏡下形態(tài)

2.42%胰蛋白酶是制備抗酸染色質(zhì)控片最佳的消化濃度 1%胰蛋白酶作為消化濃度，37 ℃消化1 h后顯微鏡下仍可見少量黏液絲，提示或許以1%胰蛋白酶作為消化濃度并非是最佳的。1%、2%、5%、10%胰蛋白酶作為消化液，在37 ℃孵箱中孵育30 min，通過外觀、抗酸和革蘭染色顯微鏡下觀察，2%胰蛋白酶消化30 min是最好的消化濃度。

2.52%胰蛋白酶消化20 min能達(dá)到最佳的消化效果 10 min時肉眼見痰液黏稠，流動性不佳；20 min可達(dá)到理想的消化效果，而消化40 min時痰液呈稀薄呈水狀，提示細(xì)胞被消化，顯微鏡下結(jié)果證實(shí)2%胰蛋白酶消化20 min能達(dá)到最佳的消化效果(圖7)。

圖7 不同時間點(diǎn)2%胰蛋白酶37 ℃消化 濃痰后的外觀比較

2.6制備不同級別抗酸染色項(xiàng)目室間質(zhì)量評價質(zhì)控片 利用充分消化的痰液稀釋200倍取10 μL制備2 cm2菌膜(+)，稀釋100倍取10 μL制備2 cm2菌膜(++)，稀釋50倍取10 μL制備2 cm2菌膜(+++)，稀釋10倍取10 μL制備2 cm2菌膜(++++)。

2.7穩(wěn)定性評價結(jié)果 高壓滅菌121 ℃、20 min對膿腫分枝桿菌ATCC 19977菌體形態(tài)無影響，但會對背景細(xì)胞造成破壞，進(jìn)而影響染色背景，不宜作為室間質(zhì)量評價質(zhì)控片的滅菌方式。紫外線滅菌24 h和80 ℃高溫烘烤對膿腫分枝桿菌ATCC 19977菌體形態(tài)及背景細(xì)胞染色均無影響，可作為滅菌的方法，且對質(zhì)控片穩(wěn)定性無影響。對紫外線滅菌24 h的室間質(zhì)量評價質(zhì)控片在室溫放置6個月對膿腫分枝桿菌ATCC 19977菌體形態(tài)和背景細(xì)胞的染色穩(wěn)定性無影響。

2.8均一性評價結(jié)果 隨機(jī)抽取的10張抗酸質(zhì)控片的結(jié)果都是(+++)。見表1。表明根據(jù)上述步驟做出的質(zhì)控片均一性良好。

表1 抗酸染色質(zhì)控片(+++)均一性評價

3 討 論

本研究利用膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19977作為實(shí)驗(yàn)菌株，結(jié)果顯示，在血平板上培養(yǎng)后的菌體較改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌體細(xì)長，染色后效果更為典型和便于觀察。分析可能的原因，改良羅氏培養(yǎng)基中加有孔雀綠，孔雀綠為抑菌劑，抑制其他雜菌生長的同時，對膿腫分枝桿菌生長有部分抑制作用，使改良羅氏培養(yǎng)基上的膿腫分枝桿菌菌體形態(tài)短小，制備成室間質(zhì)量評價質(zhì)控片后普通光學(xué)顯微鏡不利于觀察，即不能用于抗酸染色室間質(zhì)量評價質(zhì)控片的制備。另一方面，在最佳的消化液選擇過程中，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對濃痰消化使用最多的消化液為胰蛋白酶和NALC，本研究進(jìn)一步比較了2種常用消化劑對濃痰的消化作用，結(jié)果顯示，胰蛋白酶消化效果明顯優(yōu)于NALC。分析其原因，濃痰成分主要是黏多糖、黏蛋白[9]，而胰蛋白酶為蛋白水解酶，對精氨酸和賴氨酸肽鏈具有水解作用，可使痰液中的酸性糖蛋白和黏蛋白等水解為多肽或氨基酸[10]，所以，胰蛋白酶能有效對痰液進(jìn)行消化，使各類細(xì)菌與細(xì)胞呈游離暴露狀態(tài)；而NALC為半胱氨酸的N-乙酰化衍生物，分子中含有巰基，能使黏蛋白肽鍵的二硫鍵(-S-S-)斷裂，只能使黏蛋白變成相對小的肽鏈，其消化效果明顯弱于胰蛋白酶。

相較于改良羅氏培養(yǎng)基，血平板上的膿腫分枝桿菌在顯微鏡下的形態(tài)更加細(xì)長，而改良羅氏培養(yǎng)基上的膿腫分枝桿菌短小，不易觀察。因此，對抗酸染色項(xiàng)目室間質(zhì)量評價質(zhì)控片的制備，血平板是培養(yǎng)膿腫分枝桿菌的良好培養(yǎng)基；通過革蘭染色和抗酸染色后利用顯微鏡鏡檢觀察質(zhì)控片的背景，確定胰蛋白酶為最佳的消化液，最佳消化濃度為2%，最佳消化條件是37 ℃下消化20 min。另外，制備成0.50麥?zhǔn)蠞舛鹊哪撃[分枝桿菌通過使用胰蛋白酶消化后的痰液進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，可得到不同等級的抗酸染色室間質(zhì)量評價質(zhì)控片，且能保證其均勻和穩(wěn)定。

抗酸染色項(xiàng)目因其操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)，受到我國各級臨床實(shí)驗(yàn)室的青睞，其準(zhǔn)確度對臨床的診斷至關(guān)重要。目前尚未見關(guān)于如何標(biāo)準(zhǔn)化制備抗酸染色室間質(zhì)量評價質(zhì)控片的相關(guān)文獻(xiàn)報道，本研究基于重慶市臨床檢驗(yàn)中心的平臺，首次探討了標(biāo)準(zhǔn)化制備穩(wěn)定、均一抗酸染色室間質(zhì)量評價指控片的方法，并成功用于重慶市各臨床實(shí)驗(yàn)室抗酸染色項(xiàng)目的能力驗(yàn)證，保證了全市開展該項(xiàng)目臨床實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的準(zhǔn)確性。