血清microRNA-155水平在乳腺癌早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)中的作用

張 超，童富云△，胡 瀅

(1.重慶市涪陵中心醫(yī)院乳腺甲狀腺血管外科，重慶 408000；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，重慶 400038)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)[1]。隨著手術(shù)，放、化療技術(shù)的飛速發(fā)展及多模態(tài)成像設(shè)備的應(yīng)用，治療乳腺癌的療效得到了極大的改善。然而，乳腺癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)仍不能得到有效的控制，是乳腺癌患者致死的主要原因[2]。早期診斷乳腺癌并根據(jù)預(yù)后預(yù)測(cè)指導(dǎo)全程最佳治療達(dá)到減少?gòu)?fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的目的具有重要的研究意義。在乳腺癌早期診斷的標(biāo)志物中微小RNA(microRNA)正受到越來(lái)越多的關(guān)注[3-6]。近期有研究表明，microRNA-155的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其機(jī)制主要包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞凋亡等[7-9]?；颊哐錷icroRNA-155水平與臨床病理的關(guān)系及其對(duì)診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)的作用已成為目前的研究熱點(diǎn)。本研究通過(guò)回顧性分析乳腺癌患者與健康女性血清microRNA-155水平，研究其在乳腺癌早期診斷與預(yù)后評(píng)價(jià)中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年9月至2013年12月重慶市涪陵中心醫(yī)院經(jīng)病理檢查診斷為乳腺癌的81例女性患者的外周血樣本及相對(duì)應(yīng)的病理切片作為研究組。乳腺癌病理診斷標(biāo)準(zhǔn)采用WHO乳腺腫瘤的病理分型，入組患者均為美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)乳腺癌臨床實(shí)踐指南臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期的患者，且尚未開始接受手術(shù)等其他治療。收集同期在重慶市涪陵中心醫(yī)院健康體檢的80例健康女性的外周血樣本作為對(duì)照組。對(duì)照組均為成年、非妊娠、無(wú)嚴(yán)重心肺疾病的健康女性。乳腺癌組患者年齡35～75歲，平均(51.26±6.99)歲；對(duì)照組健康女性年齡29～76歲，平均(50.87±7.52)歲。兩組研究對(duì)象年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已獲得該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同時(shí)，經(jīng)患者或親屬授權(quán)并簽署本研究知情同意書。

1.2方法

1.2.1提取總RNA 采集兩組研究對(duì)象血液標(biāo)本5 mL于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，靜置30 min，然后4 000 r/min(離心半徑20 cm)離心25 min，將上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的Eppendorf離心管中，每管200 μL，根據(jù)RNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)說(shuō)明書的要求，采用Trizol法提取RNA。

1.2.2microRNA的逆轉(zhuǎn)錄 采用microRNA q聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(南京凱基生物有限公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。具體反應(yīng)體系為包括50 ng/μL的模板RNA，25 U/μL的Poly A聚合酶1 μL，RTase Mix 1μL,PAP/RT緩沖液10 μL，使用焦碳酸二乙酯(DEPC)水將體系調(diào)整至30 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為37 ℃ 60 min、70 ℃ 15 min。克隆用PCR引物(蘇州金維智科技有限公司)：上游引物3′-GGATCCGGTGGCACAAACCAGGAA-5′；下游引物5′-GAATTCTCTAAGTTTATCCAGCAGGGTG-3′。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)microRNA 采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR的方法檢測(cè)樣本中microRNA-155的表達(dá)水平。具體反應(yīng)體系包括10 μL的2×Mix 、2 μL通用引物、2 μL特異引物、2 μL cDNA等，然后使用無(wú)RNA酶的雙蒸水將體系調(diào)整為25 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，循環(huán)數(shù)(Ct)為50。

1.2.4計(jì)算microRNA相對(duì)表達(dá)量 使用U6內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行均一化。通過(guò)Ct值計(jì)算microRNA-155相對(duì)表達(dá)水平，即熒光PCR信號(hào)達(dá)到預(yù)設(shè)閾值所需要的Ct。ΔΔCt可計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)。ΔCT樣本=CT樣本-CT內(nèi)參;ΔCT對(duì)照=CT對(duì)照-CT內(nèi)參;ΔΔCT=ΔCT樣本=ΔCT對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1兩組研究對(duì)象血清microRNA-155表達(dá)水平比較 乳腺癌組患者血清microRNA-155表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，是對(duì)照組的3.5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.71,P=0.001)。見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象血清microRNA-155相對(duì) 表達(dá)水平比較

2.2microRNA-155表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 microRNA-155表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者microRNA-155表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。然而，microRNA-155表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤分期、腫瘤直徑、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)等無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 microRNA-155表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床 病理特征的關(guān)系(n=81)

圖1 microRNA-155表達(dá)的ROC曲線

2.3microRNA-155表達(dá)水平在乳腺癌中的診斷價(jià)值 血清microRNA-155水平診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.941(95%可信區(qū)間：0.899～0.982)，臨界值為1.165，靈敏度、特異度分別為84.2%和91.3%。microRNA-155表達(dá)水平對(duì)乳腺癌具有較高的診斷價(jià)值。見(jiàn)圖1。

2.4microRNA-155表達(dá)水平在乳腺癌預(yù)后評(píng)價(jià)中的價(jià)值 以microRNA-155表達(dá)的中位數(shù)2.49將研究組或者分為小于2.49組(40例)和大于或等于2.49組(41例)。兩組患者生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.811，P=0.027)。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組患者生存率比較

3 討 論

乳腺癌治療的關(guān)鍵在于早期診斷與干預(yù)，因此，發(fā)現(xiàn)新的易于檢測(cè)且具有一定靈敏度和預(yù)后預(yù)測(cè)作用的早期診斷分子標(biāo)志物具有極大的臨床意義，從健康人群中篩查、鑒別出早期乳腺癌患者，進(jìn)而提高乳腺癌早期診斷的效率，并盡早開始綜合治療，達(dá)到提高療效的目的。

microRNA是參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的一類非編碼RNA，國(guó)內(nèi)外研究均表明，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[10-12]。microRNA-155是一種多功能microRNA，血循環(huán)中主要來(lái)自于細(xì)胞，因血循環(huán)中其多與蛋白相結(jié)合，穩(wěn)定性好，故是作為腫瘤標(biāo)志物研究的基礎(chǔ)。

本研究比較了乳腺癌患者和健康者血清microRNA-155的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，乳腺癌患者血清microRNA-155表達(dá)水平明顯高于健康女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[13]，即microRNA-155在乳腺癌患者血清中的表達(dá)顯著升高。本研究通過(guò)制作ROC曲線發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)血清microRNA-155表達(dá)水平對(duì)乳腺癌具有較高的診斷價(jià)值，ROC曲線下面積為0.941，靈敏度、特異度分別為84.2%和91.3%，與國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果相符[14-15]。

盡管鉬靶檢查等常規(guī)篩查手段在目前乳腺癌診斷中具有重要地位，但已有研究表明，microRNA-155診斷乳腺癌的診斷價(jià)值比鉬靶更高[16]。鉬靶還因輻射、乳腺組織本身等因素的影響導(dǎo)致應(yīng)用受限。而檢測(cè)microRNA-155表達(dá)更易獲取檢測(cè)標(biāo)本，對(duì)受試者基本無(wú)創(chuàng)傷和痛苦，操作方法成熟，是潛在的良好的診斷乳腺癌的標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，血清microRNA-155的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者血清microRNA-155表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，而與患者年齡、是否絕經(jīng)、激素受體等臨床病理特點(diǎn)無(wú)關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)果基本一致[17]。表明microRNA-155的高表達(dá)可能導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移正是乳腺癌患者致死的主要原因。本研究Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，不同microRNA-155表達(dá)水平組患者生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，microRNA-155高表達(dá)提示預(yù)后較差，原因可能是microRNA-155通過(guò)調(diào)控促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而加快腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)程[18]。

4 結(jié) 論

microRNA-155的表達(dá)在乳腺癌的診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)中具有重要意義,可能成為診斷乳腺癌并根據(jù)預(yù)后預(yù)測(cè)指導(dǎo)臨床治療的重要標(biāo)志物。