FBXO22對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響

方虹舒，張 薇

(重慶市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400014)

有研究表明,絕大多數(shù)的乳腺癌相關(guān)死亡是由于發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移而不是原發(fā)腫瘤[1]。惡性乳腺癌的進(jìn)展是一個(gè)高度復(fù)雜的過(guò)程,主要涉及腫瘤生長(zhǎng)和侵襲后轉(zhuǎn)移性傳播到遠(yuǎn)端的器官[2]。為提高臨床療效，迫切需要確定控制乳腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展的決定性分子因素和抗轉(zhuǎn)移治療的新靶點(diǎn)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過(guò)三步級(jí)聯(lián)酶調(diào)控泛素依賴性蛋白水解，涉及泛素激活酶(E1)、泛素偶聯(lián)酶(E2)和泛素連接酶(E3)[3]。真核生物E3中最大的家族是SKP1-Cullin-F-box蛋白(SCF)E3連接酶復(fù)合體[4]。其中F-box蛋白家族是其主要部分，通過(guò)蛋白-蛋白互作基序與底物結(jié)合，確定底物特異性[5-6]。迄今為止，絕大多數(shù)F-box蛋白的生物學(xué)功能和生理底物仍未明確?，F(xiàn)有研究表明，F(xiàn)BXO22通過(guò)介導(dǎo)泛素依賴性降解腫瘤抑制因子——KLF4，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[7]。最新研究表明，F(xiàn)BXO22基因沉默后能降低結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。然而，F(xiàn)BXO22對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力及其相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚。本研究探究了FBXO22基因沉默后對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，并初步探究了其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)及胎牛血清購(gòu)自Hylcone公司(美國(guó))，胰酶及Transwell小室購(gòu)自Millipore公司(美國(guó))，磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自武漢博士德公司，小干擾RNA(siRNA)-FBXO22(FBXO22-siRNA組)及對(duì)照siRNA(Control-siRNA組)購(gòu)自上海吉瑪公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo Fisher公司(美國(guó))，F(xiàn)BXO22、E-cadherin、波形蛋白(Vimentin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9購(gòu)自CST公司(美國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，置于5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，并于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%～70%。按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照說(shuō)明書(shū)分別用培養(yǎng)基將siRNA(FBXO22-siRNA組)和Lipofectamine 2000試劑(Control-siRNA組)稀釋后在室溫下孵育5 min，然后將二者輕輕混合，在室溫下孵育20 min。將復(fù)合物加入到每個(gè)包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中。37℃、CO2培養(yǎng)箱孵育24～96 h。采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將細(xì)胞分為只有試劑對(duì)照的對(duì)照組(Control)，轉(zhuǎn)染對(duì)照，siRNA的Control-siRNA組以及轉(zhuǎn)染FBXO22的FBXO22-siRNA組。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化，以5×105個(gè)/孔接種到6孔板中。24 h后用槍頭進(jìn)行劃線，用PBS清洗3次，去除劃下的細(xì)胞后加入無(wú)血清培養(yǎng)基。放入37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48 h后取出拍照。

1.2.4Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化，用DMEM制成單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/孔接種于Transwell上室內(nèi)。Transwell下室內(nèi)加入含10%胎牛血清的DMEM。37℃、CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)20 h后取出Transwell小室，棄上室培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞。然后用95%乙醇固定膜下表面細(xì)胞，取下Transwell小室膜，經(jīng)結(jié)晶紫染色后置于載玻片上封片。在光鏡(100×)下觀察遷移細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算平均遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.5Western blot 收集轉(zhuǎn)染48 h后的MDA-MB-231細(xì)胞，提取總蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。在恒壓條件下采用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳法電泳分離蛋白，然后在恒流條件下將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，用10%脫脂奶粉封閉4 h后加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST洗滌3次后加入二抗37 ℃孵育2 h，用TBST洗滌3次后采用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) FBXO22-siRNA組MDA-MB-231細(xì)胞中FBXO22蛋白表達(dá)水平明顯低于Control-siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。表明FBXO22-siRNA下調(diào)了乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中FBXO22的蛋白表達(dá)水平。

注：與Control-siRNA組比較，*P<0.05

圖1轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞中FBXO22表達(dá)水平

2.2下調(diào)FBXO22蛋白表達(dá)水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 FBXO22-siRNA組MDA-MB-231細(xì)胞中發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移者明顯低于Control-siRNA組及對(duì)照組(Control)。見(jiàn)圖2。表明FBXO22蛋白表達(dá)下調(diào)后乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲能力明顯減弱。

圖2 下調(diào)FBXO22對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3下調(diào)FBXO22蛋白表達(dá)水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 與Control-siRNA組及對(duì)照組比較，F(xiàn)BXO22-siRNA組MDA-MB-231細(xì)胞中穿過(guò)transwell小室膜的數(shù)目明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。表明FBXO22蛋白表達(dá)下調(diào)后乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移能力明顯降低。

注：A表示對(duì)照組(Control)；B表示Control-siRNA組；C表示FBXO22-siRNA組；與Control-siRNA組及對(duì)照組比較，*P<0.05

圖3下調(diào)FBXO22對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

2.4下調(diào)FBXO22蛋白表達(dá)水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白水平的影響 FBXO22蛋白表達(dá)水平下調(diào)后MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平升高， Vimentin表達(dá)水平降低，與細(xì)胞侵襲遷移能力相關(guān)的MMP-2、MMP-9蛋白水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。表明下調(diào)FBXO22基因能引起上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程相關(guān)蛋白——E-cadherin和Vimentin表達(dá)發(fā)生改變，以及侵襲遷移相關(guān)蛋白——MMP-2和MMP-9水平下降。

注：*P<0.05

圖4下調(diào)FBXO22對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

F-box蛋白是介導(dǎo)磷酸化依賴性泛素的SCF泛素蛋白連接酶復(fù)合物的4個(gè)亞基之一[8]。F-box蛋白分為3類(lèi):含有WD-40結(jié)構(gòu)域的Fbws，含有富含亮氨酸重復(fù)序列的Fbls，以及含有不同蛋白-蛋白相互作用模塊或無(wú)識(shí)別基序的Fbxs[9]。FBXO22蛋白屬Fbxs類(lèi)，作為腫瘤蛋白p53的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，被認(rèn)為參與了p53誘導(dǎo)后特異性蛋白的降解[10]。FBXO22能通過(guò)調(diào)控p21 的泛素化水平而影響其降解進(jìn)而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[11]。此外，在腎細(xì)胞癌中FBXO22能通過(guò)抑制MMP-9介導(dǎo)的遷移侵襲及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)介導(dǎo)的血管生成從而阻止其遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的發(fā)生[12]。

FBXO22第一次被認(rèn)識(shí)是作為一種針對(duì)甲基化p53進(jìn)行降解的衰老相關(guān)E3連接酶，而后有研究表明，F(xiàn)BXO22通過(guò)針對(duì)賴氨酸特異性去甲基化酶4A和p53的蛋白酶體降解分別調(diào)節(jié)組蛋白甲基化標(biāo)記和衰老[13-14]。此外，F(xiàn)BXO22能通過(guò)介導(dǎo)泛素依賴性降解腫瘤抑制因子——KLF4促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展。有研究表明，F(xiàn)BXO22基因沉默后能降低結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。在黑色素瘤細(xì)胞中下調(diào)FBXO22能引起HIF-1α/VEGF通路下調(diào)從而抑制其遷移侵襲及血管生成能力[15]。本研究通過(guò)Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證明了FBXO22基因的表達(dá)下調(diào)后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力明顯下降。此外，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)BXO22蛋白表達(dá)下調(diào)后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。表明下調(diào)FBXO22能使乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲能力減弱。

EMT是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程。在慢性炎癥、胚胎發(fā)育、癌癥轉(zhuǎn)移、組織重建及多種纖維化疾病中均具有重要作用[16]。通過(guò)EMT，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的能力等間質(zhì)表型[17]。EMT是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程[18]。有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞之間的相互作用可能影響腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[19-20]。在體外脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MCF-7共培養(yǎng)能引起共培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng)，且EMT呈時(shí)間依賴性變化[21]。還有研究表明，敲除乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA LincK能通過(guò)抑制EMT從而使其在裸鼠中肺轉(zhuǎn)移水平明顯下降[22]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)FBXO22基因的表達(dá)水平能引起MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平上升，Vimentin表達(dá)水平下降。而EMT的主要特征是上皮標(biāo)記物(如E-cadherin)的丟失，同時(shí)，間充質(zhì)標(biāo)記物如Vimentin表達(dá)增加[23]。下調(diào)FBXO22基因表達(dá)使乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的上皮標(biāo)記物水平增高，同時(shí)，降低了間充質(zhì)標(biāo)記物水平。表明FBXO22基因表達(dá)下調(diào)能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

MMP是一種鈣依賴性含鋅內(nèi)源性肽酶，可降解各種ECM蛋白[24-25]。MMP在癌癥進(jìn)展中的主要意義之一是其在ECM降解中的作用，MMP-2與MMP-9一起能降解基底膜中最豐富的成分即Ⅳ型膠原，ECM降解可使癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤中轉(zhuǎn)移出來(lái)形成轉(zhuǎn)移灶[26-28]。有研究表明，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-2、MMP-9高表達(dá)，且在其侵襲及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[29]。此外，MMP-2與其他MMP已被證明可酶解激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)從而促進(jìn)EMT進(jìn)程，進(jìn)而引發(fā)癌癥轉(zhuǎn)移[30]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)FBXO22基因后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)下降，表明FBXO22基因的表達(dá)下調(diào)引起乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲能力下降的可能機(jī)制為MMP-2、MMP-9水平下降。

4 結(jié) 論

下調(diào)FBXO22基因水平能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移侵襲能力，其可能的機(jī)制為FBXO22基因表達(dá)下調(diào)抑制了MDA-MB-231細(xì)胞EMT進(jìn)程，并使細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)重要蛋白--MMP-2、MMP-9表達(dá)減少。