寄生醉馬草的孢囊線蟲種類鑒定

張譯文，李惠霞，陳秀菊，徐鵬剛，郭 靜，張淑玲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 / 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

醉馬草(Achnatherum inebrians)是多年生草本植物，屬于禾本科(Gramineae)芨芨草屬(Achnatherum)，是我國(guó)北方天然草原上的一種烈性毒草，在內(nèi)蒙古、西藏、青海、甘肅、新疆和寧夏等省(區(qū))均有分布[1-3]。因其抗旱、耐寒等優(yōu)勢(shì)，加之有毒性，牲畜較少取食，在退化草原中蔓延日益嚴(yán)重[4]，直接影響了草地質(zhì)量和載畜量，已成為發(fā)展草地畜牧業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境建設(shè)的主要限制因素之一。在新疆昌吉，每年因醉馬草侵占而減少的草地載畜量為200萬～300萬羊單位，可造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過1億元[5]。目前關(guān)于醉馬草的研究，主要集中在醉馬草和內(nèi)生真菌共生體方面。研究表明，內(nèi)生真菌可提高醉馬草的耐旱性[6]、耐寒性[7]、抗蟲性[8]、抗病性[9]和對(duì)重金屬脅迫的耐受性[10]；醉馬草可為內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，二者為互利互惠的關(guān)系。據(jù)報(bào)道，在甘肅天然草地上，醉馬草植株的內(nèi)生真菌帶菌率近100%[11]。郭長(zhǎng)輝等[12]研究發(fā)現(xiàn)，帶內(nèi)生真菌醉馬草根際土壤線蟲密度高于不帶內(nèi)生真菌醉馬草，并且內(nèi)生真菌可以改變土壤線蟲，特別是植物寄生線蟲的類群組成。

線蟲可寄生于植物的各個(gè)部位，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)不良，同時(shí)還會(huì)傳播其他植物病害，引起植物發(fā)病[13]。孢囊線蟲是線蟲門側(cè)尾腺綱墊刃目異皮科(Heteroderidae)可形成孢囊的線蟲統(tǒng)稱，是一種固著性植物線蟲。孢囊線蟲廣泛分布于世界各地，可為害小麥(Triticum aestivum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、大豆(Glycine max)等多種作物，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。我國(guó)每年在小麥上，禾谷孢囊線蟲 (Heterodera avenaeWollenweber) 的為害面積就達(dá) 333.33萬 hm2[14]，造成20%～30%的減產(chǎn)[15]。孢囊線蟲是否可寄生在醉馬草等其他禾本科植物上，目前尚未見報(bào)道。因此，本研究通過運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)天祝高寒草甸醉馬草根際孢囊線蟲進(jìn)行鑒定，以明確醉馬草根部孢囊線蟲的種類，為醉馬草的生物防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 孢囊線蟲的采集和分離

1.1.1 孢囊線蟲的采集

采樣地點(diǎn)設(shè)置在甘肅省天?？h抓喜秀龍鄉(xiāng)、打柴溝鎮(zhèn)。兩地屬大陸性高原季風(fēng)氣候，年均降水量400～500 mm，年均氣溫-2 ℃。植被類型屬于草甸草原，土壤以黑鈣土、栗鈣土為主。

于2017年7月，依據(jù)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)線蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[16]，在孢囊線蟲分布較多的采樣點(diǎn)，選取醉馬草生長(zhǎng)較集中的區(qū)域，對(duì)醉馬草根際10 cm范圍內(nèi)土壤用工兵鏟進(jìn)行采集，每份樣品取醉馬草植株1叢和根圍土樣約500 g，將樣品用封口袋混勻密封帶回實(shí)驗(yàn)室，放入4 ℃恒溫箱保存。采樣時(shí)記錄經(jīng)緯度、海拔、生境等信息。樣品采集信息如表1所列。

1.1.2 孢囊線蟲的分離

將土樣放在紙上自然陰干，醉馬草植株暫時(shí)放置在4 ℃恒溫箱里冷藏備用。孢囊線蟲的分離方法采用簡(jiǎn)易漂浮分離法，具體做法如下：將自然陰干的土樣稱取500 g倒入水桶中，連續(xù)攪拌，使土樣充分溶解于水中，靜置1 min，然后將含有土樣的溶液倒入孔徑為0.71 mm和0.3 mm的樣品套篩(0.71 mm在上，0.3 mm在下)中，將上述步驟重復(fù)3次。用小水流沖洗0.71 mm樣品篩上的雜質(zhì)，盡可能使0.71 mm樣品篩上的孢囊線蟲沖洗至0.3 mm樣品篩上，沖洗完后棄除，再用小水流小心清洗0.3 mm篩上的剩余物質(zhì)，待通過篩孔的水流澄清時(shí)將0.3 mm篩上的剩余物質(zhì)完全沖洗至0.15 mm尼龍紗上，在體視顯微鏡下挑取剩余物中的孢囊線蟲，統(tǒng)計(jì)并收集孢囊線蟲。再將醉馬草植株根部白雌蟲計(jì)入孢囊數(shù)據(jù)。將孢囊切開，直接可得到卵和二齡幼蟲[17]。

1.2 孢囊線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定方法

在顯微鏡(蔡司，德國(guó)，Scope A1)和體視顯微鏡(蔡司，德國(guó)，Discovery V12)下，測(cè)量并拍照醉馬草上分離得到的孢囊線蟲孢囊、卵和二齡幼蟲的主要形態(tài)特征，制作陰門錐和二齡幼蟲玻片。觀察和測(cè)量的形態(tài)特征包括：受精卵長(zhǎng)、寬；二齡幼蟲蟲體長(zhǎng)、體寬、基部球?qū)?、口針長(zhǎng)、透明尾長(zhǎng)；孢囊長(zhǎng)、寬；陰門錐膜孔類型，陰門膜孔長(zhǎng)、寬，陰門裂長(zhǎng)，下橋的有無，泡狀突的有無。參考劉維志[18]和段玉璽[19]關(guān)于孢囊線蟲的分類描述特征進(jìn)行種類鑒定。

表1 天祝草原醉馬草樣品采集信息Table 1 Sampling information for Achnatherum inebrians from Tianzhu steppe

1.2.1 陰門錐玻片的制作

將飽滿的孢囊線蟲在盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿內(nèi)浸泡24 h，用毛筆尖將浸過的孢囊挑在載玻片的一邊，用解剖刀切下蟲體后端，用昆蟲針仔細(xì)清除附著在孢囊內(nèi)側(cè)的內(nèi)含物，將陰門錐的邊緣修整齊，以陰門錐的面積不超過陰門錐膜孔面積的5～10倍為宜。將修整好的陰門錐放入40%的H2O2中漂白5 min，再依次放入70%、95%和100%的酒精中脫水，最后放入丁香油中透明，將透明后的陰門錐移至載玻片上觀察、拍照。

1.2.2 二齡幼蟲玻片的制作

將二齡幼蟲吸至載玻片上的水滴中，熱殺死后，用三乙醇胺-福爾馬林 (Triethanolamine Formalin,TAF) 固定液固定線蟲。吸取浮載劑滴至干凈的玻片中間，將固定后的二齡幼蟲挑至浮載劑中。選取5 mm左右的支撐物，放在浮載劑的邊緣，蓋上蓋玻片，用濾紙吸取多余的浮載劑，用封片劑封片，待封片劑干燥后貼上標(biāo)簽，觀察、拍照。

1.3 孢囊線蟲分子鑒定

1.3.1 孢囊線蟲DNA的提取

參考廖金玲等[20]的方法提取4個(gè)孢囊線蟲DNA。挑取用于形態(tài)觀察的孢囊線蟲的卵和二齡幼蟲放入滅過菌的Eppendorf管中，加入10 μL雙蒸水、3 μL蛋白酶 K、7 μL 10 × PCR-buffer(含 Mg2+)，在液氮中速凍30 s，取出后用75%的乙醇消毒的玻璃研磨棒快速研磨，待Eppendorf管中液體溶解后再將其放入液氮中迅速冷凍研磨。將研磨好的樣液放入-20 ℃ 的冰箱中冷凍 2 h，然后將 Eppendorf管置于 65 ℃ 下保溫 1 h，94 ℃ 滅活 10 min，放入-20 ℃分裝保存，備用。

1.3.2 孢囊線蟲ITS1和28S核糖體DNA序列的PCR擴(kuò)增

本研究采用 25 μL 的 PCR 反應(yīng)體系：10 × PCR buffer(500 mmol·L-1KCl，100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)，15 mmol·L-1MgCl2) 2.5 μL、25 mmol·L-1MgCl22.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、5 × 103mol·L-1Taq DNA聚合酶 0.2 μL、106mol·L-1上下引物各 1 μL、模板DNA 2 μL，剩余用ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。以無菌水代替模板DNA作為陰性對(duì)照。ITS1-rDNA序列的擴(kuò)增引物為PXb101(TTGATTACGTCCCTGCCCTTT)和ChR(ACGAGCCGAGTGATCCACCG)；28S-rDNA序列的擴(kuò)增引物為28-61(GTCGTGATTACCCGCTGAACTTA)和28-1001(GTTCGATTAGTCTTTCGCCCCT)。PCR擴(kuò)增條件相同：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 50 s，55 ℃ 退火 50 s，72 ℃ 延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，將擴(kuò)增產(chǎn)物放入-20 ℃ 保存。取 5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在用Goodview染色的1%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為 0.1 × TAE, 100 V 下電泳 45 min，用BIORAD成像儀在紫光燈下觀測(cè)。

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及序列系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用軟件MAGA 6.0進(jìn)行序列拼接并在Genbank上注冊(cè)，在NCBI中用BLAST進(jìn)行比較，下載同源性較高的序列，用最大似然法在軟件MEGA 6.0中分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 醉馬草根部孢囊線蟲的發(fā)生情況

本研究采集到醉馬草根及根際土樣共35份，有3份土樣中分離到孢囊線蟲，其中1份醉馬草根部發(fā)現(xiàn)有白色雌蟲寄生(圖1A、B、C)。孢囊線蟲的檢出率為8.57%，3份樣品中每100 g土樣的孢囊數(shù)分別為7、23和11個(gè)。

2.2 孢囊線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

分離自醉馬草根系的孢囊線蟲群體形態(tài)特征為：新鮮孢囊有亞晶層(圖1C)。一個(gè)月后蟲體變深褐色，呈檸檬形，角質(zhì)層厚，頸部明顯，有突出的陰門錐(圖1D)。陰門膜孔為雙膜孔(圖1E)，無下橋，陰門裂明顯，有發(fā)達(dá)的泡狀突(圖1F)。二齡幼蟲為線型(圖1J)，唇區(qū)圓形(圖1H)，頭部跟身體連接處有明顯縊縮，基部球較大，口針強(qiáng)壯。尾部圓錐形(圖1I)，透明區(qū)較長(zhǎng)，末端尖銳，醉馬草孢囊線蟲主要形態(tài)測(cè)量值如表2所列。天祝地區(qū)寄生醉馬草的孢囊線蟲群體形態(tài)描述和測(cè)量特征值與陳品三等[21]所描述的禾谷孢囊線蟲基本一致，并參考Mulvey等[22]、Handoo[23]、李惠霞等[24]對(duì)禾谷孢囊線蟲形態(tài)的描述，將該線蟲群體鑒定為禾谷孢囊線蟲 (Heterodera avenaeWollenweber)。

2.3 孢囊線蟲的分子生物學(xué)特征分析

2.3.1 ITS1核糖體DNA序列特征與聚類分析

將4個(gè)孢囊線蟲擴(kuò)增的ITS1-rDNA序列分別編號(hào)為：B1(MG262561)、B2(MG550972)、B3(MG550973)、B4(MG550974)。醉馬草上孢囊線蟲的ITS1-DNA序列長(zhǎng)度均為792 bp，序列的一致性為100%，B1～B4與中國(guó)禾谷孢囊線蟲群體(KR704399)相似性為99%。將所得序列與NCBI中下載的孢囊屬(Heterodera)和球形孢囊屬(Globodera)ITS-rDNA序列進(jìn)行Clustal比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明：17個(gè)序列聚為3個(gè)分支，B1～B4與中國(guó)(KR704309)、捷克(KX573040)、德國(guó)(KF225722)禾谷孢囊線蟲群體聚為1個(gè)分支，并與禾谷孢囊線蟲復(fù)合種群中的其他5個(gè)群體 (比利時(shí)群體 AF274400、AF498381、KM504378、AF274402和美國(guó)群體GU079654)聚為一支，置信度為93%。孢囊線蟲屬的其他線蟲群體(AY347919、AF498378、AY166438)聚為一支，置信度為100%。外群球孢囊屬線蟲群體(GQ294525、DQ097514)聚為一支。孢囊線蟲ITS1序列類聚分析結(jié)果顯示，醉馬草上孢囊線蟲的種類為禾谷孢囊線蟲。

圖1 醉馬草群體孢囊線蟲形態(tài)特征圖Figure 1 Illustration of cyst nematodes on A. inebrians

表2 天祝醉馬草孢囊線蟲群體與已報(bào)道群體的孢囊、陰門錐、二齡幼蟲、受精卵形態(tài)測(cè)量值Table 2 Morphometrics of cysts, vulval cones, second stage juveniles, and fertilized eggs of H. avenae in A. inebrians from Tianzhu, and other populations reported

圖2 基于最大似然法構(gòu)建的醉馬草孢囊線蟲群體1TS1核糖體DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 2 Phylogenetic tree of cyst nematode population of A. inebrians based on the ITS1-rDNA sequences using the maximum likelihood method

2.3.2 28S-rRNA D2～D3區(qū)序列特征與聚類分析

將4個(gè)孢囊線蟲擴(kuò)增的28S-rDNA序列分別編號(hào)：C1(MG266696)、C2(MG5-51855)、C3(MG551854) 、C4(MK757873)]。醉馬草孢囊線蟲群體的28S核糖體DNA序列長(zhǎng)度均為1 063 bp，序列的一致性為100%，將所得序列與NCBI中下載的孢囊屬和球形孢囊屬28S核糖體DNA序列進(jìn)行Clustal比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，17個(gè)序列聚為3個(gè)分支，C1～C4與捷克(KX573052)、中國(guó)(GU595438)、意大利(LT159826)禾孢囊線蟲群體聚為1個(gè)分支，并與孢囊線蟲復(fù)合種群中的中國(guó)群體GU083592和意大利群體LT159829聚為一支。孢囊線蟲屬的其他線蟲群體(DQ328687、DQ328691、DQ328693、JX402414、JQ040527、GU595452)聚為一支。外群球孢囊屬線蟲群體(EU855121、KJ409635)單獨(dú)聚為一支。孢囊線蟲28S序列類聚分析結(jié)果顯示，醉馬草上孢囊線蟲的種類為禾谷孢囊線蟲。

圖3 基于最大似然法構(gòu)建的醉馬草孢囊線蟲群體28S核糖體DNA部分序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic tree of cyst nematode population of A. inebrians based on the 28S-rDNA sequences using the maximum likelihood method

3 討論

本研究中醉馬草孢囊線蟲的形態(tài)特征與Mulvey和Golden[22]、劉維志[18]、陳品三等[21]描述的寄生于作物的禾谷孢囊線蟲一致，而與李惠霞等[24]報(bào)道的寄生于該地區(qū)矮生嵩草(Kobresia humilis)根部的禾谷孢囊線蟲在孢囊寬和二齡幼蟲長(zhǎng)等特征上略有差異。但由于孢囊線蟲屬多個(gè)種在形態(tài)上差異較小，有時(shí)很難準(zhǔn)確鑒定，所以需要結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)孢囊線蟲做進(jìn)一步鑒定。目前，植物線蟲的種類鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化研究常采用核糖體DNA(ITS序列、28S序列及18S序列)和線粒體DNA的部分序列進(jìn)行[25]。本研究選用核糖體DNA的ITS1和28S基因序列對(duì)寄生于醉馬草的孢囊線蟲群體進(jìn)行種類鑒定。鑒定結(jié)果表明，醉馬草孢囊線蟲的ITS1和28S序列分別與其他地方禾谷孢囊線蟲序列聚為一支，有較高的同源性。分子生物學(xué)方法更進(jìn)一步證明了寄生醉馬草的孢囊線蟲種類為禾谷孢囊線蟲。

禾谷孢囊線蟲主要侵染大麥屬、小麥屬、雀麥屬、高粱屬、燕麥屬、剪股穎屬、冰草屬、看麥娘屬、短柄草屬、稗屬、羊茅屬、鵝觀草屬、落草屬、黑麥草屬、鸛草屬、梯牧草屬、早熟禾屬、棒頭草屬、狗尾草屬、鼠茅屬等[26-33]多個(gè)屬的禾本科植物。這些被禾谷孢囊線蟲寄生的禾本科植物大多為小麥族和剪股穎族[34-35]。醉馬草屬于針茅族植物，是禾谷孢囊線蟲的寄主新記錄種。未來關(guān)于孢囊線蟲在針茅族植物的寄主范圍需要進(jìn)一步研究。

本研究采集的35份醉馬草根及根際土樣中，3份檢出禾谷孢囊線蟲，線蟲檢出率為8.57%，遠(yuǎn)低于采樣地周邊燕麥田44%的孢囊線蟲檢出率[36]。郭長(zhǎng)輝[37]的研究發(fā)現(xiàn)，帶內(nèi)生真菌醉馬草根際土壤線蟲密度高于不帶內(nèi)生真菌醉馬草，但不帶內(nèi)生真菌醉馬草根際土壤中植物寄生線蟲的密度更高。Townsend等[38]在種植8周后的高羊茅(Festuca arundinaceae)共生體植物土壤中檢測(cè)到穿刺短體線蟲(Pratylenchus penetrans)線蟲的數(shù)量降低到40%；在禾草共生體上北方根結(jié)線蟲(Meloidogyne hapla)、禾本科根結(jié)線蟲(M. graminis)、南方根結(jié)線蟲(M.incognita)、M. marylandi等的數(shù)量也降低[39]。由此推測(cè)，內(nèi)生真菌可能對(duì)植物線蟲寄生醉馬草有抑制作用，至于醉馬草內(nèi)生真菌與孢囊線蟲之間相互影響的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合核糖體DNA的ITS1、28S序列分析，對(duì)寄生于甘肅天祝醉馬草根部的孢囊線蟲進(jìn)行種類鑒定，將其鑒定為禾谷孢囊線蟲。這是首次報(bào)道禾谷孢囊線蟲寄生醉馬草，并可完成其生活史。