基于二氨基熒光素類熒光探針的新型一氧化氮檢測方法

王成強(qiáng)，張 玲

（上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093）

引 言

一氧化氮(NO)作為普遍存在于脊椎動(dòng)物各種細(xì)胞中的一種無機(jī)分子，參與機(jī)體內(nèi)多種生理過程，如血管平滑肌的舒張、免疫防御的調(diào)節(jié)以及中樞和自律神經(jīng)的傳導(dǎo)等，在生理學(xué)、病理學(xué)以及藥理學(xué)中均發(fā)揮著廣泛的作用[1-3]。因此，近年來對(duì)于NO的檢測受到越來越多研究者的重視，但由于其化學(xué)性質(zhì)活潑，半衰期短且生理環(huán)境下其質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化范圍很大，因此，在NO檢測中既需要較寬的檢測范圍，也需要極快的響應(yīng)時(shí)間[4-5]。

現(xiàn)有檢測NO的方法有多種，如：利用NO與金屬蛋白、金屬指示劑或重氮反應(yīng)，根據(jù)前后吸收光譜的變化來檢測的光譜法[6]；利用NO的孤對(duì)電子自由基特性的電子順磁共振波普法(EPR)[7]；根據(jù)NO與O3或H2O2反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光法[8]；利用NO被氧化成的反應(yīng)來檢測NO的電化學(xué)法[9]；直接與 NO反應(yīng)或者與NO分解的副產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生熒光的改變來實(shí)現(xiàn)檢測的熒光檢測法[10]等等。不同NO檢測方法應(yīng)用于不同的分析領(lǐng)域，與其他技術(shù)相比，熒光檢測法具有較好的靈敏度、時(shí)空分辨率、選擇性和可操作性[11]?？茖W(xué)家們已經(jīng)研究出諸多用于NO檢測的熒光探針，近年其中一種新型二氨基熒光素類NO探針DAF-FM(4-amino-5-methylamion-2'，7'-difluorofluorescein)得到了廣泛應(yīng)用。相對(duì)于之前常用的DAF-2熒光探針，DAF-FM在多方面表現(xiàn)出更好的性能，如與NO加合反應(yīng)而成的熒光產(chǎn)物受pH的影響較小，熒光更加穩(wěn)定不易淬滅，對(duì)NO的檢測靈敏度更高等[11]。DAF-FM本身具有很弱的熒光，光量子產(chǎn)率僅為0.005左右，與NO反應(yīng)后因生成熒光素化合物，發(fā)強(qiáng)烈綠色熒光，光量子產(chǎn)率可高達(dá)0.81，因此可根據(jù)DAF-FM熒光強(qiáng)度的變化來判斷NO的相對(duì)含量。

納米金顆粒即尺寸在1～100 nm范圍內(nèi)的金微小顆粒，其制備方法簡單，粒徑均勻，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，主要采用物理法和化學(xué)法制備[12]。物理法制備納米金顆粒主要是通過分散技術(shù)將塊體金轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米粒子，主要包括真空沉積法、激光消融法等。而化學(xué)法是以金的化合物為原料，利用還原反應(yīng)生成金納米粒子，通過調(diào)整反應(yīng)條件控制顆粒尺寸?；诩{米金顆粒的等離子特性、量子尺寸效應(yīng)等廣泛應(yīng)用于光催化、光電子學(xué)及表面增強(qiáng)光譜等領(lǐng)域[13]，本文采用納米金顆粒與DAF-FM復(fù)合，利用金顆粒的光學(xué)增益特性有效提高了NO的檢測靈敏度，且該熒光探針可重復(fù)使用24次以上，彌補(bǔ)了DAF-FM的單次使用缺陷，實(shí)現(xiàn)了NO的可持續(xù)重復(fù)檢測。

1 納米金顆粒的制備與表征

實(shí)驗(yàn)中所用納米金顆粒是采用激光消融法制得。清洗后的金塊固定于燒杯中，加入2 mL的去離子水。納秒激光通過焦距為50 mm的凸透鏡后聚焦到金塊表面，金塊經(jīng)激光燒蝕變納米金顆粒。通過透射電鏡(TEM)觀察金顆粒及其分布，如圖1所示，實(shí)驗(yàn)所得金顆粒直徑基本小于4 nm，且一半以上直徑為1～3 nm。

圖1 納米金顆粒TEM圖與尺寸統(tǒng)計(jì)分布圖Fig. 1 TEM image of gold nanoparticles and the statistical chart of particle size

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

為了研究納米金顆粒在NO檢測中的作用，分別采用DAF-FM和DAF-FM/納米金顆粒復(fù)合材料對(duì)與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 000 ppm(1 ppm=10-6)的NO進(jìn)行反應(yīng)，并采用405 nm激光激發(fā)，監(jiān)測DAF-FM-NO熒光強(qiáng)度隨著納米金顆粒的加入以及反應(yīng)時(shí)間增加而發(fā)生的變化。圖2(a)中的譜線1為DAF-FM表面剛接觸NO時(shí)的熒光光譜，光譜2為60 s后的熒光光譜，熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定且維持在300左右。當(dāng)檢測液中DAF-FM與納米金顆粒比例為1 ∶ 1時(shí)，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 000 ppm的NO進(jìn)行反應(yīng)，其熒光光譜如圖2(a)中的譜線3和4，其中譜線3為剛通入NO時(shí)的熒光光譜，譜線4為NO通入60 s后的熒光光譜。由圖可見金顆粒的加入有效地提高了DAF-FMNO的熒光強(qiáng)度，同時(shí)，通入NO后的熒光強(qiáng)度有明顯的變化，60 s時(shí)熒光強(qiáng)度可增大82%。由此可見，納米金顆粒能夠有效放大熒光信號(hào)并提升DAF-FM的響應(yīng)速度及靈敏度。

圖2 不同比例的DAF-FM與納米金顆粒的混合液體對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NO的熒光強(qiáng)度變化Fig. 2 Fluorescence intensity variation of mixed liquids with different ratios between DAF-FM and gold

通過調(diào)整DAF-FM與納米金顆粒之間的比例可進(jìn)一步提高檢測靈敏度。不同比例DAF-FM/納米金顆粒復(fù)合材料對(duì)對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 ppm、10 ppm及1 000 ppm的NO反應(yīng)曲線如圖2(b)～(d)所示。由圖2(b)可知，反應(yīng)最初5 s內(nèi)熒光強(qiáng)度迅速增大，尤其當(dāng)DAF-FM與納米金顆粒比例為2 ∶ 1時(shí)，其熒光強(qiáng)度的增幅最為突出可達(dá)12%，增幅遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于不含金顆粒的DAF-FM。不同比例DAF-FM/納米金顆粒復(fù)合材料對(duì)對(duì)10 ppm NO的響應(yīng)見圖2(c)，由圖可見變化趨勢與圖2(b)中基本一致，在DAF-FM與金顆粒比例為2 ∶ 1時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)最為顯著。同樣地，圖2(d)為DAF-FM/納米金顆粒復(fù)合材料對(duì)對(duì)1 000 ppm NO的響應(yīng)，通過觀察折線變化可知，此時(shí)DAF-FM與納米金顆粒最佳配比為1 ∶ 2。由此可見，對(duì)于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NO氣體檢測，DAFFM中金顆粒最佳添加量有所不同，這主要是由熒光增強(qiáng)和熒光淬滅雙重效應(yīng)所導(dǎo)致的。當(dāng)熒光分子處于金屬納米顆粒附近時(shí)，由于金屬納米顆粒表面等離子體局域場增強(qiáng)效應(yīng)會(huì)提高熒光分子的激發(fā)效率，產(chǎn)生熒光增強(qiáng)，同時(shí)，與金顆粒之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光分子的量子產(chǎn)率降低，發(fā)生熒光淬滅效應(yīng)。在DAF-FM/納米金顆粒檢測NO的過程中，這兩種效應(yīng)并存，適量的金顆?？梢猿浞址糯驞AF-FM-NO的熒光強(qiáng)度，對(duì)于熒光的增強(qiáng)高于淬滅，但當(dāng)金顆粒含量過高時(shí)，淬滅效應(yīng)變得更顯著，一定程度上減弱了熒光增強(qiáng)。當(dāng)NO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，DAFFM-NO熒光團(tuán)數(shù)量多，產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，此時(shí)多數(shù)熒光團(tuán)信號(hào)得到同時(shí)放大才會(huì)有較明顯的熒光強(qiáng)度提升，因此需要較多的金顆粒。而當(dāng)NO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，DAF-FM-NO熒光團(tuán)數(shù)量少，產(chǎn)生熒光較弱，少量熒光團(tuán)信號(hào)得到放大就能顯著改變總熒光強(qiáng)度，因此，少量的金顆粒便可達(dá)到最佳效果，金顆粒過量則會(huì)導(dǎo)致淬滅加劇。因此在利用金屬納米離子提高DAF-FM檢測靈敏度及相應(yīng)速度時(shí)，應(yīng)結(jié)合實(shí)際需求調(diào)整納米金粒子的添加量。

為了進(jìn)一步探究添加納米金顆粒的DAFFM熒光探針在NO檢測中的使用壽命，我們采用比例為1 ∶ 1的DAF-FM/納米金顆粒復(fù)合材料對(duì)對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 000 ppm的NO進(jìn)行多次重復(fù)檢測，每次取5 s時(shí)刻的熒光增強(qiáng)幅度，其熒光變化如圖3所示，在15次使用之前，熒光增強(qiáng)幅度維持在20%左右，而在15次之后，其熒光增幅在7%左右，到第24次已經(jīng)無熒光增強(qiáng)。在實(shí)際應(yīng)用中，動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的NO質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)小于1 000 ppm，由此可推斷，添加納米金顆粒后的DAF-FM檢測試劑可重復(fù)使用24次以上。

圖3 DAF-FM與納米金顆粒比例為1∶1的檢測液對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1000 ppm的NO反應(yīng)隨檢測次數(shù)的熒光強(qiáng)度的變化Fig. 3 Change in fluorescence intensity with detection times when the liquids with DAF-FM and gold nanoparticles in a ratio of 1∶1 reacted with NO at a concentration of 1000 ppm

3 結(jié)論與展望

本文提出了一種基于DAF-FM/納米金顆粒復(fù)合材料對(duì)的NO檢測方法，顯著提高了NO檢測的靈敏度，且可多次使用。該方法可以拓展到其他氣體的檢測中，可為醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測等提供參考。