柿樹根際嗜鐵細菌地衣芽孢桿菌CAS20的分離鑒定

王滌非 侯長明 張坤鵬 王潔 艾呈祥 余賢美

摘要：采用CAS檢測平板法，從柿樹根際土壤中分離獲得一株具有較強產(chǎn)嗜鐵素能力的細菌菌株CAS20。根據(jù)菌株在LB固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征和生理生化特性，將其初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillus）;經(jīng)16S rDNA序列分析，CAS20的16S rDNA基因序列（KY199559）與地衣芽孢桿菌（Bacillus. licheniformis）代表菌株ATCC14580的16S rDNA 序列（NR_074923）具有99.93%的相似性，并且位于系統(tǒng)進化樹的同一分枝。據(jù)此，將菌株CAS20鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

關(guān)鍵詞：柿樹根際土壤;嗜鐵細菌;地衣芽孢桿菌;生理生化特性;16S rDNA 序列分析

中圖分類號：S154.39文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）04-0065-04

Abstract The bacterium strain CAS20 producing siderophore was isolated from persimmon rhizosphere by CAS agar plate assay， and was identified as Bacillus based on the cultural characteristics on LB agar plate and physiological-biochemical characteristics. The 16S rDNA sequence analysis showed that the 16S rDNA sequence （KY199559） of CAS20 shared the identity of 99.93% with that of Bacillus.licheniformis strain ATCC14580 （NR_074923）， and they were located on the same branch of the phylogenetic tree. So the bacterium strain CAS20 was identified as Bacillus licheniformis.

Keywords Persimmon rhizospheric soil; Bacteria producing siderophore; Bacillus licheniformis; Physiological-biochemical characteristic; 16S rDNA sequence analysis

芽孢桿菌（Bacillus sp.）能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的強抗逆性內(nèi)生芽孢，具有抑菌譜廣、易于產(chǎn)業(yè)化、易于存活和定殖等優(yōu)點，對多種植物病害具良好防效，能促進植物生長、提高作物產(chǎn)量，在生防領(lǐng)域占有重要地位，許多性狀優(yōu)良的芽孢桿菌菌株已被成功應(yīng)用于植物病害的防治，具有廣泛的應(yīng)用前景[1-4]。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種常見的芽孢桿菌，革蘭氏陽性，在促進植物生長和防治植物病害領(lǐng)域有非常突出的應(yīng)用價值，是理想的生防菌篩選對象[5-8]。

本研究采用CAS檢測平板法，從柿樹根際土壤中分離獲得一株嗜鐵細菌菌株CAS20，通過生理生化特性及16S rDNA序列分析，將該菌株鑒定為地衣芽孢桿菌，可為柿樹病害的防治提供生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

從山東省果樹研究所萬吉山柿樹試驗基地采集柿樹根際土壤，帶回實驗室備用。

1.2 嗜鐵細菌的分離篩選

采用CAS檢測平板法[9，10]進行細菌菌株的篩選和純化，根據(jù)CAS檢測平板中橘黃色暈圈的有無及大小，篩選出產(chǎn)嗜鐵素能力較強的菌株。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 生理生化特性 將獲得的菌株在LB平板上劃線接種，于37℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。菌株的生理生化特性參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]進行分析。

1.3.2 分子鑒定 通過16S rDNA序列分析對獲得的菌株進行分子鑒定。所用引物為細菌16S rDNA通用引物[12]，P1F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，P2R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。以37℃振蕩培養(yǎng)過夜的菌液為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min;94℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃ 2 min，30個循環(huán);72℃10 min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量，并回收PCR產(chǎn)物，委托上海生工生物工程有限公司進行16S rDNA測序。利用NCBI的Blastn搜索數(shù)據(jù)庫和DNAssist軟件進行序列同源性比較分析，并采用DNAMAN 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株CAS20的獲得

經(jīng)CAS檢測平板篩選及純化，從柿樹根際土壤中獲得一株具有較強嗜鐵能力的細菌菌株CAS20。該菌株在藍色CAS檢測平板上產(chǎn)生明顯的橘黃色暈圈，嗜鐵圈直徑為3.65 cm（圖1）。

2.2 CAS20的生理生化特性

在LB固體培養(yǎng)基平板上，CAS20菌落呈乳白色，邊緣不整齊，直徑2～6 mm，細胞呈桿狀，能在20～41℃條件下生長。CAS20的生理生化特性測定結(jié)果見表1。根據(jù)菌株在LB培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)特征和生理生化特性，將CAS20初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillus）。

2.3 CAS20的分子鑒定

通過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，獲得長約1 500 bp的片段，經(jīng)測序，該片段長為1 542 bp。經(jīng)Blastn搜索，CAS20與地衣芽孢桿菌B. licheniformis菌株ATCC14580（NR_074923）的16S rDNA 序列僅有1個堿基的差異，具有99.93%的相似性（圖2），而且兩者位于系統(tǒng)進化樹（圖3）的同一分枝。因此，將CAS20鑒定為地衣芽孢桿菌（B. licheniformis），并將其16S rDNA序列提交到GenBank，登錄號為KY199559。

3 討論與結(jié)論

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）可產(chǎn)生孢子抵抗惡劣環(huán)境、穩(wěn)定性強，產(chǎn)生的生物活性酶、抗菌肽、桿菌肽等多種抗性物質(zhì)直接抑制病原菌生長，或誘導(dǎo)植物對病原菌的防御反應(yīng)提高植物的病害防治效果，還可促進作物生長，提高作物產(chǎn)量[5-8，13]。該菌近年來受到越來越多的關(guān)注，是理想的生防菌篩選對象。

嗜鐵細菌通過分泌嗜鐵素，與植物根際病原微生物爭奪鐵營養(yǎng)，從而抑制病原微生物生長繁殖，起到生物防治作用;同時，植物可利用嗜鐵細菌產(chǎn)生的嗜鐵素所螯合的鐵，改善植物的鐵營養(yǎng)，促進植物生長，并防治堿性缺鐵土壤植物的缺鐵失綠癥[9，10]。嗜鐵細菌分泌的嗜鐵素可富集藍色CAS檢測平板中的鐵離子，在菌落周圍形成橘黃色暈圈[9]。

本試驗從柿樹根際土壤中分離得到一株細菌菌株CAS20，在CAS檢測平板上產(chǎn)生的嗜鐵圈直徑為3.65 cm，具有較強的產(chǎn)嗜鐵素能力。經(jīng)LB固體平板培養(yǎng)、生理生化特性分析及16S rDNA序列分析，將CAS20鑒定為地衣芽孢桿菌（B. licheniformis），其16S rDNA基因序列（KY199559）與地衣芽孢桿菌代表菌株ATCC14580的16S rDNA 序列（NR_074923）僅有1個堿基的差異，具有99.93%的相似性，且兩株菌位于系統(tǒng)進化樹的同一分枝。有關(guān)菌株CAS20在防治植物病害和促進植物生長方面的作用，還有待于進一步研究。

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