基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析叉頭盒蛋白FoxO1在前列腺癌中的表達(dá)及其作用

胡 婕，巢健茜*

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)療保險(xiǎn)教研室，江蘇南京 210009)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性中最常見的惡性腫瘤之一，在過去幾十年中，前列腺癌的發(fā)病率一直在增加，其在美國男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因中排第3位[1-2]。近年來，我國男性前列腺癌發(fā)病率也呈逐漸上升趨勢，并且發(fā)病年齡逐漸趨向年輕化，這對我國男性健康產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅[3]。有研究顯示，在65歲以上老年人中，約30%患有前列腺癌，很多患者是在中晚期才確診，雖然大多數(shù)PCa患者預(yù)后相對較好，但治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的PCa患者預(yù)后較差[4]。因此，鑒定與PCa相關(guān)的標(biāo)志物將有助于正確的臨床決策以及改善PCa患者的預(yù)后。

叉頭盒(Fox)蛋白是轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其特征在于存在高度保守的“叉頭”或“翼狀螺旋”DNA結(jié)構(gòu)域。Fox家族中存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，均具有相似的DNA結(jié)構(gòu)——含有110個(gè)氨基酸殘基的保守序列[5-6]。最近的研究表明Fox家族參與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程，F(xiàn)ox蛋白具有雙重作用，因?yàn)樗梢耘c相同靶DNA序列的啟動(dòng)子區(qū)競爭性結(jié)合以影響轉(zhuǎn)錄，部分家族成員甚至既可以作為腫瘤抑制基因，同時(shí)在其他腫瘤中又對致癌基因有調(diào)節(jié)作用，介導(dǎo)腫瘤惡性生物學(xué)的各種表型[7-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxA1、FoxK1和FoxJ1等是PCa復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物[9-11]。然而，F(xiàn)oxO1在PCa中的作用尚未明確。

在本項(xiàng)研究中，我們旨在探討FoxO1在前列腺組織中的表達(dá)，并分析FoxO1表達(dá)與PCa患者臨床病理特征之間的關(guān)系。通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)公共數(shù)據(jù)集研究FoxO1對前列腺癌預(yù)后的影響，為進(jìn)一步研究FoxO1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供線索和思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集

通過cBioPortal網(wǎng)站(http://www.cbioportal.org)從TCGA數(shù)據(jù)集下載并預(yù)處理前列腺癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)RNAseq或基因表達(dá)微陣列的數(shù)據(jù)以及臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)行病理相關(guān)性分析和預(yù)后分析。

1.2 利用GEPIA分析FoxO1基因表達(dá)水平

GEPIA網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大學(xué)最新開發(fā)的交互式Web服務(wù)器，用于分析來自TCGA和GTEx項(xiàng)目的9 736個(gè)腫瘤樣本和8 587個(gè)正常樣本的RNA序列表達(dá)數(shù)據(jù)[12]。GEPIA網(wǎng)站提供了可定制的功能：比如腫瘤和正常組織的差異表達(dá)分析。因此我們在PCa(197例)及正常前列腺組織中(100例)分析了FoxO1基因的RNA表達(dá)水平，并且用箱形圖來展示結(jié)果。

1.3 利用人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫分析FoxO1的蛋白表達(dá)

人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜(The Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org)是基于RNA測序分析和免疫組化分析的大型轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)庫，是瑞典2003年發(fā)起的項(xiàng)目[13]，可用于組織和細(xì)胞系的免疫染色，也可用于分析正常組織和腫瘤組織蛋白的差異表達(dá)[14]。本研究引用網(wǎng)站中FoxO1免疫組化抗體(CAB022326)對正常前列腺組織和PCa組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，分析FoxO1在正常前列腺組織和PCa組織中的蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對197例PCa樣本建立患者臨床資料庫，將患者年齡、飲酒情況、TNM分期、腫瘤分化程度和FoxO1表達(dá)水平等指標(biāo)量化賦值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床病理相關(guān)資料分析采用卡方檢驗(yàn)，對PCa組織中mRNA和蛋白水平的變化情況，建立PCa患者生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較不同F(xiàn)oxO1表達(dá)水平患者生存曲線的差異。單因素和多因素分析采用Cox回歸模型，分析前列腺癌患者臨床指標(biāo)對前列腺癌患者預(yù)后的影響；根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對樣本的FoxO1表達(dá)進(jìn)行由低到高排序，將高于中位數(shù)的值定義為高表達(dá)，低于中位數(shù)的值定義為低表達(dá)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 FoxO1 mRNA在PCa組織中的表達(dá)

使用GEPIA平臺(tái)分析FoxO1 mRNA表達(dá)水平的結(jié)果見圖1。與正常前列腺組織相比，F(xiàn)oxO1 mRNA在PCa組織中表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 FoxO1 mRNA在PCa和正常前列腺組織中的表達(dá)

2.2 FoxO1 mRNA表達(dá)與PCa臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

在TCGA數(shù)據(jù)集中，F(xiàn)oxO1 mRNA的表達(dá)與TNM分期中T分期(腫瘤浸潤深度)、M分期(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)以及分化程度顯著相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、飲酒等情況無明顯相關(guān)關(guān)系，見表1。

表1 FoxO1 mRNA表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

2.3 FoxO1 mRNA表達(dá)與PCa患者預(yù)后的關(guān)系

本研究中共197例PCa患有相應(yīng)的預(yù)后信息，應(yīng)用GEPIA檢測了FoxO1 mRNA與PCa患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO1 mRNA表達(dá)水平與預(yù)后存在相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，F(xiàn)oxO1 mRNA表達(dá)水平越低，患者預(yù)后越差。在早期，F(xiàn)oxO1 mRNA低表達(dá)與高表達(dá)的PCa患者總生存率無顯著差異(P>0.05)，后期隨著時(shí)間推移，F(xiàn)oxO1 mRNA低表達(dá)者總生存率顯著下降(圖2A)。而FoxO1 mRNA低表達(dá)者無病生存率始終明顯低于FoxO1 mRNA高表達(dá)的PCa患者(P<0.05，圖2B)。以上結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO1可能是PCa的腫瘤抑制基因，其低表達(dá)與患者生存期縮短顯著相關(guān)。運(yùn)用Cox回歸法分析患者生存狀況的影響因素。結(jié)果表明年齡、T分期(腫瘤浸潤深度)、分化程度、FoxO1 mRNA表達(dá)可作為PCa患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，見表2。

2.4 FoxO1蛋白在PCa組織中的表達(dá)情況

利用Atlas蛋白(免疫組化)數(shù)據(jù)庫，分析在正常前列腺組織和PCa組織中FoxO1蛋白的表達(dá)，免疫組化結(jié)果如圖3所示，F(xiàn)oxO1蛋白在正常前列腺組織中染色程度較高，而在PCa中呈較低水平。說明FoxO1蛋白表達(dá)水平在PCa組織中較正常前列腺組織降低。

圖2 PCa患者FoxO1 mRNA表達(dá)的生存期曲線

表2 影響前列腺癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

前列腺癌(PCa)現(xiàn)已成為除膀胱癌、腎腫瘤外的第3大常見多發(fā)于男性泌尿生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，并且缺乏有效的治療手段[15]。PCa具有發(fā)病隱匿，進(jìn)展緩慢等特點(diǎn)，早期癥狀不明顯，出現(xiàn)癥狀時(shí)診斷大多已到中晚期階段。目前對于PCa的診斷主要通過前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)檢測及經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)下前列腺穿刺活檢，其檢測的靈敏度和特異度較差，存在篩查不足或過度診斷等問題。因此，尋找高靈敏度和特異度的生物標(biāo)志物，提高PCa診斷準(zhǔn)確性是當(dāng)前PCa研究工作的當(dāng)務(wù)之急。

FoxO1是叉頭轉(zhuǎn)錄因子亞組的一個(gè)成員，已被證明在各種生理和病理過程中具有重要作用，包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期停滯、能量代謝、細(xì)胞凋亡、氧化壓力和抵抗[16]。多項(xiàng)研究顯示，F(xiàn)oxO1作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子可抑制多種腫瘤的發(fā)生并削弱幾種實(shí)體癌的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。羅娟等[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1通過磷酸化、乙?；确g后修飾調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)參與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)過程，從而抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，因此，增強(qiáng)FoxO1表達(dá)或修復(fù)FoxO1活性是抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的重要因子。Fan等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-370能夠調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力，而這個(gè)過程是通過FoxO1實(shí)現(xiàn)的，過表達(dá)miR-370后，F(xiàn)oxO1水平下降，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。Zhao等[19]研究發(fā)現(xiàn)了FoxO1的另一種抑癌機(jī)制，在結(jié)腸癌中FoxO1被乙?；⑥D(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，胞質(zhì)中的FoxO1能增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡和自噬而起到抗癌作用。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)集，分析PCa中FoxO1的表達(dá)與PCa預(yù)后的關(guān)系。我們首先比較FoxO1在PCa組織和正常前列腺組織中的表達(dá)：在GEPIA平臺(tái)中分析TCGA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)FoxO1 mRNA水平在PCa中顯著低表達(dá)；且FoxO1 mRNA的表達(dá)與腫瘤浸潤深度和分化程度相關(guān)，即惡性程度越高的患者FoxO1 mRNA表達(dá)水平越低；生存分析結(jié)果顯示FoxO1 mRNA表達(dá)和預(yù)后生存之間具有相關(guān)性，F(xiàn)oxO1 mRNA低表達(dá)患者的預(yù)后顯著差于高表達(dá)患者；多因素Cox回歸分析顯示FoxO1可以作為判斷PCa患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，在Atlas蛋白數(shù)據(jù)庫中從蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)一步證實(shí)FoxO1在PCa中低表達(dá)，上述結(jié)果提示FoxO1基因在前列腺癌中有可能作為臨床預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述，本文通過對TCGA轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫的挖掘，表明FoxO1可能成為PCa的診斷標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)。同時(shí)表明FoxO1基因在PCa中可能是一個(gè)潛在的抑癌基因，有必要進(jìn)一步去研究該基因在PCa中的機(jī)制及功能，為FoxO1在腫瘤中的基礎(chǔ)和臨床研究提供線索和依據(jù)，亦為PCa的靶向治療提供新思路。