多功能非病毒載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用

肖 月，李格非，劉 丹，陳 婷，林桂淼*

(深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 深圳 518060)

傳統(tǒng)的腫瘤治療方式包括手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射性治療，這些治療方式并不能有效地阻止腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，并且由于化療的耐藥性、放療的副作用，使得它們的療效受到限制。而基因治療的興起為癌癥治療帶來了新的希望，其核心技術(shù)在于運(yùn)用載體將治療基因遞送到患者的細(xì)胞中，通過替代突變基因、敲除異常表達(dá)基因或補(bǔ)充缺失基因，從而達(dá)到精準(zhǔn)且靶向的治療目的。

在1990年，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)基因轉(zhuǎn)移到具有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)的兩個兒童的T細(xì)胞中，這是基因治療第一次應(yīng)用于臨床試驗[1]。在這之后的20年里，全世界已經(jīng)批準(zhǔn)了1700多個關(guān)于基因治療的臨床試驗[2]。用于臨床試驗的載體主要分為病毒載體與非病毒載體。但病毒載體存在的安全問題限制了它的應(yīng)用，臨床試驗中首例死亡案例正是與腺病毒載體所帶來的嚴(yán)重免疫反應(yīng)有關(guān)[3]。與之相比，非病毒載體具有更加優(yōu)越的安全性，且易于制備，可攜帶大量核酸，但其缺點(diǎn)在于轉(zhuǎn)染效率低下，基因表達(dá)的持續(xù)時間短。

傳統(tǒng)的非病毒載體包括物理載體及化學(xué)載體，物理遞送方式包括直接注射裸DNA、電穿孔、基因槍、聲孔效應(yīng)、流體動力基因轉(zhuǎn)移等。但這些治療方式并不能有效的保護(hù)基因不被核酸酶降解。化學(xué)載體包括無機(jī)納米顆粒(二氧化硅、磁性納米粒子、磷酸鈣、金納米粒子、碳納米粒子、量子點(diǎn)等)、陽離子聚合物、脂質(zhì)體等。這些載體易于被化學(xué)基團(tuán)包裝修飾，從而克服將基因遞送入核的層層障礙[4]。但是，早期的非病毒載體存在作用單一、靶向性差、轉(zhuǎn)染效率低且無法示蹤等缺點(diǎn)，以至不能達(dá)到很好的治療效果。為此，近年來，人們發(fā)展了一系列多功能病毒載體。

1 多功能非病毒載體概述

多功能非病毒載體是在傳統(tǒng)非病毒載體的基礎(chǔ)上研發(fā)出的一系列具有多項功能的非病毒載體遞送系統(tǒng)。它將多種功能整合于同一個非病毒載體中，使之能同時實現(xiàn)靶向、成像、示蹤、光熱療、載藥或可控釋藥等。例如Kogure等[5]設(shè)計了多功能包絡(luò)型納米器件(multifunctional envelope-type nano device，MEND)，這種MEND可以通過層層包裝，在特定時點(diǎn)執(zhí)行特定的功能，從而實現(xiàn)將基因遞送入核的屏障。它們可以通過表面官能化來減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取、逃逸細(xì)胞的內(nèi)吞作用、保護(hù)核酸免于過早降解、添加配體以靶向到達(dá)腫瘤部位[6]。

此外，一些無機(jī)納米粒子也可以利用其自身材料特性，發(fā)展為多功能載體。例如磁性納米顆?？梢宰鳛榇殴舱癯上竦脑煊皠?；金納米顆?？梢援a(chǎn)生光熱效應(yīng)；量子點(diǎn)顆?？梢赃M(jìn)行示蹤成像；還有些納米顆?？赏瑫r搭載藥物與基因。對這些特殊的材料進(jìn)行包裝，不僅能有效的將基因藥物遞送入細(xì)胞內(nèi)，同時能通過外部干擾達(dá)到最佳的抑癌作用。如今發(fā)展的“組合”納米醫(yī)學(xué)，將多功能非病毒載體運(yùn)用于化學(xué)藥物的遞送，已在癌癥治療中進(jìn)行了大量的實驗，證實能夠有效減少腫瘤細(xì)胞的耐藥性及化療藥物的副作用[7]。雖然，多功能非病毒載體在運(yùn)載基因中的應(yīng)用不如化學(xué)藥物成熟，但是也處于快速發(fā)展中。

目前，多功能非病毒載體在腫瘤基因治療領(lǐng)域涵蓋了影像導(dǎo)向基因治療、光熱驅(qū)動基因治療和聯(lián)合藥物基因治療等。

2 多功能非病毒載體的應(yīng)用

2.1 影像導(dǎo)向基因治療

影像導(dǎo)向基因治療，是指非病毒載體既可以進(jìn)行影像成像，又可以進(jìn)行基因運(yùn)載，在醫(yī)學(xué)影像導(dǎo)向作用下實現(xiàn)腫瘤的基因治療。影像導(dǎo)向基因治療的多功能非病毒載體以磁性納米顆粒最為常見。磁性納米顆粒是指具有磁性的鐵、鎳、鈷等材料合成的納米顆粒，它們可在臨床實踐中被用作磁共振成像(MRI)的對比增強(qiáng)劑。以氧化鐵為核心材料合成的超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中作用廣泛[8]。使用磁性納米顆粒作為遞送基因的載體可以通過多種方式提高癌癥治療的有效性。首先，磁性納米顆粒可作為造影劑用于MRI監(jiān)測并定量測定其在體內(nèi)的分布情況，這有利于控制藥物劑量。第二，通過成像作用可以對療效進(jìn)行評估。第三，磁性納米材料通過影像導(dǎo)向作用可以靶向于腫瘤的特異位點(diǎn)，從而提高了治療的選擇性，減小副作用，降低治療成本。同時，利用磁場驅(qū)動是一種非侵入性的治療方式[9]。

Wu等[10]運(yùn)用了SPION運(yùn)載siRNA治療肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，用聚乙二醇(PEG)連接聚乙烯亞胺(PEI)對SPIONs進(jìn)行官能化修飾，并連接三肽精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD)從而使siRNA能夠靶向且高效地到達(dá)HCC細(xì)胞中，SPION可作為體外和體內(nèi)成像的MRI探針，對此遞送系統(tǒng)的治療效果進(jìn)行了評估。同樣針對HCC，Guo等[11]利用葉酸靶向遞送系統(tǒng)Fa-PEG-g-PEI-SPION/p siRNA-TBLR有效地使人類HCC細(xì)胞系中的TBLR1基因沉默，從而抑制HCC細(xì)胞增殖及血管生成。該遞送系統(tǒng)因包含SPION，對于MRI檢測具有高靈敏度，使其可以運(yùn)用MRI技術(shù)輕松追蹤載體的遞送途徑。

除HCC以外，影像導(dǎo)向基因治療還廣泛應(yīng)用在其他類型的癌癥研究中。Gd-NGO/Let-7g/EPI遞送系統(tǒng)通過對釓(Gd)官能化修飾，將miRNA遞送至人類膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，同時可作為造影劑幫助確定血腦屏障的開放位置和開放程度，以便精準(zhǔn)計算藥量[12]。Lin等[13]運(yùn)用SPION通過MRI導(dǎo)向?qū)iRNA遞送入人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞，以克服多藥耐藥性乳腺癌。Fe3O4@SiO2(FITC)PEI-FA/Notch-1 shRNA遞送系統(tǒng)能夠高效率將Notch-1 shRNA遞送入人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，同時有效保護(hù)shRNA免受外源性DNaseI和核酸酶的降解。磁共振成像和熒光成像顯示癌細(xì)胞能優(yōu)先吸收此納米復(fù)合物[14]。此外，影像導(dǎo)向基因治療還可應(yīng)用于肺腺癌[15]、鼻咽癌[16]的治療研究。

在眾多研究應(yīng)用中，我們發(fā)現(xiàn)SPIONs等磁性示蹤載體材料在血液中代謝過快，具有不穩(wěn)定性，這些缺點(diǎn)限制著其在臨床上作為影像導(dǎo)向多功能非病毒載體的實用性，但將基因治療與成像示蹤技術(shù)結(jié)合在一起，為非病毒載體在腫瘤基因治療應(yīng)用上提供了一種新思路，通過實時成像有利于觀察治療基因在體內(nèi)的分布以及腫瘤對治療基因的反應(yīng)，便于及時調(diào)整治療方案等，這對臨床腫瘤的診斷與治療有著不可估量的價值。

2.2 光熱驅(qū)動基因治療

光熱驅(qū)動基因治療也是近年發(fā)展起來的一種新的基因治療策略，是通過在組織中誘導(dǎo)熱療殺死癌細(xì)胞并協(xié)同基因治療的一種新方法。傳統(tǒng)的熱療通常是侵入性的，容易造成非特異性的細(xì)胞損傷。如今開發(fā)出的金納米材料(AuNs)具有獨(dú)特的光熱性能，能夠在近紅外光(NIR)的照射下，將光能轉(zhuǎn)化為熱能，并且具有穩(wěn)定性、良好的生物相容性和易于制備等優(yōu)點(diǎn)[17]。運(yùn)用此類載體將治療基因遞送入細(xì)胞內(nèi)，同時在外部近紅外光的照射下，對腫瘤部位進(jìn)行非侵入性的光熱療法，從而達(dá)到更加有效的抑癌作用。

很多非病毒載體都可以用于光熱驅(qū)動基因治療，如金納米棒(AuNRs)。Shen等[18]利用AuNRs作為siRNA的載體，在其表面運(yùn)用PEI逐層組裝修飾，使MDA-MB-231和SUM-159乳腺癌細(xì)胞系中的丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)表達(dá)下調(diào)。并在轉(zhuǎn)染后用NIR照射AuNRs，在近紅外輻射下，激發(fā)的帶電粒子衰減到周圍的介質(zhì)中，產(chǎn)生熱量，腫瘤細(xì)胞對熱敏感，從而得以將基因治療與光熱療法相結(jié)合，達(dá)到理想的抑癌作用。此外，利用殼聚糖-金納米棒(Chit-Au NRs)遞送系統(tǒng)可對三陰性乳腺癌同時進(jìn)行基因沉默和光熱消融治療[19]。使用載有多西他賽(DTX)和p65 siRNA的金納米棒能有效治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌，抑制癌細(xì)胞的增殖和肺轉(zhuǎn)移[20]。

除金納米材料以外，能進(jìn)行光熱療法的還有氧化石墨烯(GO)、單壁碳納米管(SWNT)等。Yin等[21]將氧化石墨烯聚乙二醇化，有效遞送HDAC1和K-Ras siRNA進(jìn)入胰腺癌細(xì)胞MIAPaCa-2內(nèi)，實現(xiàn)雙重基因沉默效應(yīng)并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時聯(lián)合使用NIR光熱療法抑制體內(nèi)腫瘤體積增長>80%。運(yùn)用功能化的單壁碳納米管遞送系統(tǒng)SWNT-PEI/siRNA/NGR作用于PC-3人前列腺癌細(xì)胞，基因沉默和NIR光熱療法的組合顯著提高了治療效果[22]。

碳納米材料與金納米材料都能有效地運(yùn)載基因并介導(dǎo)NIR光熱療法。但是，仍有許多尚未解決的問題限制其臨床應(yīng)用。例如，劑量依賴性及細(xì)胞毒性，雖然材料本身可被認(rèn)為無毒，但其修飾基團(tuán)或降解產(chǎn)物仍然可能產(chǎn)生毒性。

2.3 聯(lián)合藥物基因治療

由于腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性以及化療藥物帶來的不良反應(yīng)，傳統(tǒng)化療藥物的抑癌作用非常局限。因此，基因與藥物的聯(lián)合遞送系統(tǒng)近來受到越來越多的關(guān)注。將基因療法與化學(xué)療法結(jié)合，可以有效降低藥物耐藥性，協(xié)同增強(qiáng)抗癌效果。這種方法的難點(diǎn)在于如何進(jìn)行共同遞送，因為核酸與小分子藥物具有顯著不同的物理化學(xué)性質(zhì)[23]。能夠同時攜帶基因與藥物的納米載體要求具備非免疫原性、無毒、有效濃縮和固定核酸，并能夠封裝小分子等特點(diǎn)[24]。

Zheng等[25]應(yīng)用 PEI修飾的新型 TPGS-b-(PCL-ran-PGA)納米粒子同時遞送腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和內(nèi)皮抑素至HeLa細(xì)胞中，內(nèi)皮抑素可以有效抑制血管生成，兩者協(xié)同產(chǎn)生抗癌作用，使針對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著增加。Xiong等[26]基于β-環(huán)糊精共軛多聚賴氨酸(PLCD)與透明質(zhì)酸共同遞送靶向肝細(xì)胞癌(HCC)的基因和化療藥物，設(shè)計出了具有核-殼結(jié)構(gòu)的新型超分子納米粒子系統(tǒng)。該納米顆?？梢酝ㄟ^CD44受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有效地將多柔比星(DOX)和oligo RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到HCC細(xì)胞中，顯著抑制細(xì)胞增殖。Reddy等[27]設(shè)計了pH敏感脂質(zhì)體納米載體用于同時遞送紫杉醇和Bcl-2 siRNA，該多功能載體可以對黑色素瘤進(jìn)行協(xié)同治療，以減少化療的耐藥性。此外，聯(lián)合藥物基因治療還廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)細(xì)胞瘤[12]、非小細(xì)胞肺癌[28]、結(jié)直腸癌[29]、乳腺癌[30]等腫瘤的治療研究中。

聯(lián)合藥物基因治療將化療與基因治療結(jié)合在一起，可以揚(yáng)長避短，最大效率地發(fā)揮抗腫瘤的作用。通過減少藥量從而減小對正常組織的損害及不良反應(yīng)。并且由于靶向遞送，使得藥物強(qiáng)有效的針對腫瘤，從而進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤效果。盡管聯(lián)合治療具有很大的優(yōu)勢，但將藥物與基因在單一載體中有效的共同轉(zhuǎn)運(yùn)用于癌癥治療仍然是一個挑戰(zhàn)。本文對多功能非病毒載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，見表1。

表1 多功能非病毒載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用

3 應(yīng)用前景

將具有不同功能的元件組合成單個遞送系統(tǒng)用于運(yùn)載核酸，是一個具有潛力的策略，但方法仍然面臨多種困境。包括“聚陽離子困境”、“PEG困境”、“包裝與釋放困境”[31]，針對這些困境，人們也研究出了許多解決方案，例如增加或改變載體的表面涂層，輕微調(diào)整載體的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。

但若想將多功能載體應(yīng)用于臨床，需要更加精確的評估載體的尺寸、表面特性及用于診斷與治療的劑量，同時需要減小修飾其表面的化學(xué)官能團(tuán)的細(xì)胞毒性，提高其生物相容性。從而得到一個理想方案，即得到一種遞送系統(tǒng)，能夠有高效的轉(zhuǎn)染效率、低生物毒性、劑量可控、并能穩(wěn)定且精準(zhǔn)的到達(dá)腫瘤部位。

同時，我們更希望研究出能夠發(fā)揮多項功能的載體材料，其不僅能夠作為MRI的造影劑，且能在近紅外光的照射下將光能轉(zhuǎn)化為熱能，同時能夠穩(wěn)定的聯(lián)合運(yùn)載基因與藥物等，以期待其在臨床應(yīng)用中達(dá)到最佳的抑癌作用。