成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白2過表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖

孫曉男，苑 青，楊荔艷，張 鈺，蔡 巖，徐 昕，王明榮，郝佳潔，*，賈雪梅*

(1．安徽醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，安徽合肥 230032；2．國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

食管癌是人類消化道惡性腫瘤之一。食管癌的主要病理類型包括食管鱗癌和食管腺癌。中國人群最常見的病理類型為食管鱗癌[1-2](以下簡稱“食管癌”)。在中國，食管癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第5，死亡率排名第4[3]，某些地區(qū)仍是世界上食管癌發(fā)病率最高的地區(qū)之一[4]。食管癌是一種進(jìn)展迅速、預(yù)后較差的惡性腫瘤。一旦被診斷為食管癌，超過50%的患者為晚期腫瘤或伴有影像學(xué)上可見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤[5]。雖然大部分食管癌患者可以通過手術(shù)治療，但仍有許多患者死于局部復(fù)發(fā)、病情進(jìn)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。食管癌患者(包括食管腺癌患者)的總體5年生存率僅為15%~25%[7]。病理分期可以作為臨床預(yù)后判斷指標(biāo)，但相同分期患者的預(yù)后可能存在很大差異，因此尋找與食管癌預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物，對于食管癌患者臨床治療和提高生存率具有重要意義。

FGFBP2屬于纖維母細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白家族基因，編碼KSP37蛋白。據(jù)報(bào)道，KSP37蛋白是由細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞CTL和NK細(xì)胞選擇性分泌的。KSP37蛋白表達(dá)升高與輕度外源性哮喘密切相關(guān)[8-9]。研究表明，F(xiàn)GFBP在致癌物誘導(dǎo)的皮膚狀細(xì)胞癌和一些結(jié)腸腫瘤組織中高表達(dá)[10]。Yamanaka等[11]觀察到FGFBP2低表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。然而，F(xiàn)GFBP2與食管癌之間的關(guān)系及其作用仍不清楚。

本研究中，我們采用組織微陣列聯(lián)合RNA原位雜交技術(shù)檢測FGFBP2 mRNA在食管癌組織中的表達(dá)，分析了FGFBP2 mRNA表達(dá)與食管癌患者臨床病理參數(shù)和術(shù)后生存時(shí)間的相關(guān)性，探討FGFBP2 mRNA表達(dá)是否可以作為食管癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。進(jìn)一步通過功能研究，檢測敲降FGFBP2對食管癌細(xì)胞系惡性表型的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本信息

190例食管癌組織和42例配對手術(shù)切緣形態(tài)學(xué)正常的組織(癌旁組織)，取自河南省林州市人民醫(yī)院病理科，上述標(biāo)本來源于190例食管癌患者手術(shù)切除組織，其中71名患者具有完整的預(yù)后信息。本研究中使用的組織均為病理診斷后剩余的標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，并簽署了知情同意書。本研究的設(shè)計(jì)和開展獲得了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(16-084/1163)。

1.2 組織芯片制備

組織標(biāo)本先經(jīng)過福爾馬林固定，石蠟包埋。然后切成厚度為4 μm的切片進(jìn)行蘇木精和伊紅(HE)染色，顯微鏡下閱片，選取相應(yīng)的組織蠟塊標(biāo)記。每個(gè)病例選取3個(gè)腫瘤組織點(diǎn)和2個(gè)正常組織點(diǎn)。將標(biāo)記好的供體蠟塊組織移入受體蠟塊，切成厚度為(5±1)μm的組織微陣列。

1.3 RNA原位雜交及評分標(biāo)準(zhǔn)

FGFBP2的RNAscope探針購自Advanced Cell Diagnostics公司(ACD，Newark，LA)。相關(guān)程序參照說明書進(jìn)行。組織芯片經(jīng)過二甲苯脫蠟和梯度乙醇洗滌兩次后，雙氧水處理10 min，靶標(biāo)修復(fù)液修復(fù)15 min；進(jìn)行RNAscope探針雜交及放大處理，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片后用NanoZoomer數(shù)字病理切片掃描儀(日本濱松)掃描。

評分采取雙盲原則。FGFBP2 mRNA表達(dá)水平根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比確定。染色強(qiáng)度分為0(陰性)、1(弱陽性)、2(中度陽性)、3(強(qiáng)陽性)。陽性細(xì)胞比例分為 0(0)、1(1%~20%)、2(21%~50%)、3(51%~100%)。腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分比的平均得分代表標(biāo)本的最終得分?！?分被認(rèn)為是陽性。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人體食管癌細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE450和KYSE510由日本京都大學(xué)的Shimada Y教授惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件參考本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表論文[13]。

1.5 小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染

FGFBP2 siRNA由上海GenPharma公司合成，其序列為：敲降靶點(diǎn)1(5′-CCTGACAGACAACCATCTCTT-3′)、敲降靶點(diǎn) 2(5′-GAACATTGTTGGAAACCCTTC-3′)和陰性對照 siRNA(5′-TTCTCCGAACGUGUCACGT TT-3′)。 使 用 Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn) 染 48 h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.6 RNA提取、cDNA合成和實(shí)時(shí)定量PCR

使用RNApure組織和細(xì)胞總RNA提取試劑盒(康為世紀(jì))提取細(xì)胞中總RNA。使用HiFi Script cDNA合成試劑盒(康為世紀(jì))進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qPCR操作步驟如文獻(xiàn)[13]所述。引物序列：FGFBP2，5′-AGAGATTCCT GCACTATGCGT-3′(正向)，5′-ACACCAGTAGGTCTG GTCTGT-3′(反向)；內(nèi)參 GAPDH，5′-TAGGCGCTCA CTGTTCTCT-3′(正 向)，5′-GTTAAAAGCAGCCCTGG TGAC-3′(反向)。

1.7 細(xì)胞增殖檢測

在KYSE150和KYSE510中轉(zhuǎn)染FGFBP2 siRNA培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，取1 000個(gè)細(xì)胞接種于含有100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基的96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天取出一塊96孔板進(jìn)行檢測。CCK-8(日本同仁化學(xué))用RPMI-1640按1∶10比例稀釋，每孔加入100 μL的CCK-8稀釋液，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀(BioTek)在450 nm處測量細(xì)胞的吸光度值，以不同處理組的吸光度值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8 Western blot

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白。加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸10 min。采用Pierce BCA蛋白檢測試劑盒(Thermo)測定蛋白濃度。20 μg蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳和PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h。采用超增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(普利萊)檢測發(fā)光信號(hào)。

實(shí)驗(yàn)過程中所用的AKT、p-AKT、ERK、p-ERK和E-cadherin一抗購自Cell Signaling Technology公司，均以1∶1 000比例稀釋。GAPDH(Cell Signaling Technology)以1∶5 000比例稀釋作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用χ2檢驗(yàn)分析FGFBP2 mRNA在食管癌組織和正常組織中的表達(dá)差異。采用Kruskal-Wallis或Mann-WhitneyU方法分析FGFBP2 mRNA表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。繪制Kaplan-Meier生存曲線，確定FGFBP2 mRNA表達(dá)與食管癌患者總生存時(shí)間的關(guān)系。單因素及多因素Cox回歸分析不同因素對患者生存的影響。生存分析針對的是總生存時(shí)間，指的是患者從手術(shù)之日起到因食管癌死亡的時(shí)間或最后一次隨訪確定患者己死亡的時(shí)間。如到隨訪截止終點(diǎn)患者仍存活，則此隨訪數(shù)據(jù)截止。采用t檢驗(yàn)對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異比較。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 FGFBP2 mRNA在食管癌患者癌組織中的表達(dá)

我們對190例食管癌組織和42例癌旁組織進(jìn)行mRNA原位雜交檢測，結(jié)果顯示食管癌組織中FGFBP2 mRNA的表達(dá)陽性率為25.8%(49/190)，而在癌旁組織中不表達(dá)(圖1)。FGFBP2 mRNA的表達(dá)水平在腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 食管癌組織和癌旁正常組織中FGFBP2 mRNA的表達(dá)情況

2.2 FGFBP2 mRNA表達(dá)情況與食管癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

我們分析了FGFBP2 mRNA的表達(dá)與食管癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系(表2)。結(jié)果顯示，F(xiàn)GFBP2mRNA陽性表達(dá)與性別、年齡、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和病理分期等指標(biāo)均無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。

表2 FGFBP2 mRNA表達(dá)與食管癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 FGFBP2 mRNA表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系

對具有隨訪資料的病例進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果顯示FGFBP2 mRNA表達(dá)影響食管癌患者術(shù)后生存時(shí)間，且FGFBP2 mRNA表達(dá)陽性患者的總生存時(shí)間明顯短于mRNA表達(dá)陰性的患者(P=0.002，圖2)。

圖2 食管癌患者FGFBP2 mRNA表達(dá)的Kaplan-Meier生存分析圖

我們對食管癌患者臨床病理指標(biāo)和FGFBP2 mRNA表達(dá)進(jìn)行了Cox單因素回歸分析，進(jìn)一步選取淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FGFBP2 mRNA表達(dá)進(jìn)行了多因素回歸分析，結(jié)果顯示FGFBP2 mRNA表達(dá)可作為食管癌患者的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后影響因素，危險(xiǎn)度為2.291，95%置信區(qū)間為1.271~4.129(P=0.006)，見表3。

表3 Cox回歸分析

2.4 敲降FGFBP2抑制食管癌細(xì)胞的增殖

利用qPCR技術(shù)檢測6株食管癌細(xì)胞系中FGFBP2的表達(dá)，結(jié)果顯示KYSE150和KYSE510中FGFBP2 mRNA水平高于其他細(xì)胞系(圖3A)，因此我們選取這兩種細(xì)胞系進(jìn)行敲降實(shí)驗(yàn)。與對照組相比，敲降FGFBP2基因可顯著抑制KYSE150和KYSE510細(xì)胞FGFBP2 mRNA的表達(dá)(圖3B，KYSE150細(xì)胞未給出)和增殖(圖3C和3D)。我們進(jìn)一步檢測了與增殖相關(guān)分子的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，在KYSE150和KYSE510中敲降FGFBP2后，AKT的磷酸化水平降低，而ERK的磷酸化水平未發(fā)生改變(圖4)。

3 討論

圖3 敲降FGFBP2抑制食管癌細(xì)胞的增殖

圖4 敲降FGFBP2后下游分子的變化

腫瘤預(yù)后分子標(biāo)志物的研發(fā)可能為腫瘤患者的治療提供潛在的靶點(diǎn)、療效預(yù)測及評價(jià)指標(biāo)。目前已有大量報(bào)道采用qPCR技術(shù)獲得食管癌潛在的預(yù)后判斷mRNA標(biāo)志物，例如ANRIL[14]、GOLM1-NAA35[15]等，也有非常少量的研究采用常規(guī)RNA原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)食管癌患者預(yù)后相關(guān)mRNA分子，例如Stathmin[16]、HCCR-1[17]等。然而，由于mRNA容易降解，特別是經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋組織中的mRNA，導(dǎo)致qPCR和常規(guī)RNA原位雜交對于檢測固定和包埋組織中的mRNA均有明顯的局限性。因此，目前尚無任何一種mRNA標(biāo)志物應(yīng)用于食管癌臨床檢測。

RNAscope原位雜交是近年來發(fā)展的一種用于檢測細(xì)胞以及經(jīng)固定和包埋組織中目標(biāo)RNA分子的原位雜交新技術(shù)，其利用雙“Z”探針(靶RNA識(shí)別序列長約18～25個(gè)堿基)和信號(hào)放大系統(tǒng)，保證信號(hào)的特異性和強(qiáng)度，具有較高的靈敏度和較低的背景。特別是，該技術(shù)對于檢測石蠟組織中的RNA分子，可以獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。由于該技術(shù)通常針對目標(biāo)RNA設(shè)計(jì)多對探針(可達(dá)20對)，利用多個(gè)短探針覆蓋目標(biāo)RNA較長的片段，可以彌補(bǔ)固定和包埋樣品中部分RNA降解對信號(hào)強(qiáng)度造成的影響[18-20]。越來越多的研究利用RNAscope原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了腫瘤患者預(yù)后相關(guān)mRNA分子[21-24]。因此，該技術(shù)有望成為腫瘤病理診斷、治療和預(yù)后判斷的手段之一。Du等[25]通過對食管癌冰凍組織進(jìn)行Western blot分析，以及對石蠟組織進(jìn)行RNAscope原位雜交分析，驗(yàn)證了KRT17蛋白和mRNA在食管癌細(xì)胞中均存在高表達(dá)，而在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)，表明RNAscope檢測結(jié)果具有較高的穩(wěn)定性。然而，到目前為止，在食管癌中使用該技術(shù)原位檢測RNA分子的研究很少，且尚無關(guān)于預(yù)后判斷RNA標(biāo)志物的報(bào)道。在本研究中，我們對食管癌組織中FGFBP2 mRNA進(jìn)行了RNAscope檢測分析，發(fā)現(xiàn)FGFBP2 mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著升高。我們的結(jié)果顯示，F(xiàn)GFBP2 mRNA僅在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常組織、以及腫瘤中的間質(zhì)細(xì)胞中均不表達(dá)，且原位雜交信號(hào)反差強(qiáng)；同時(shí)，其在預(yù)后較好和預(yù)后較差患者的腫瘤細(xì)胞中的信號(hào)反差也較明顯，表明該探針具有較高的特異性。我們發(fā)現(xiàn)FGFBP2 mRNA表達(dá)是食管癌患者的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后影響因素，提示其有潛力作為食管癌患者預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，以及為T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度等臨床病理指標(biāo)提供有效補(bǔ)充。

目前尚無關(guān)于FGFBP2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中相關(guān)機(jī)制的研究報(bào)道。本研究結(jié)果揭示了FGFBP2在食管癌細(xì)胞中的潛在作用和相關(guān)信號(hào)通路的變化，發(fā)現(xiàn)FGFBP2高表達(dá)通過激活A(yù)KT信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖。癌細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征，其受到缺氧誘導(dǎo)因子1、磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT)、胰島素樣生長因子受體1、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、以及雄激素和雌激素受體信號(hào)等的調(diào)控[26]，上述信號(hào)通路和關(guān)鍵分子可能為惡性腫瘤提供輔助診斷標(biāo)志物和潛在的分子靶點(diǎn)。PI3K/AKT和Ras/MEK/ERK是參與調(diào)控多種細(xì)胞增殖最重要的兩條信號(hào)通路[27]?；罨腁KT可通過調(diào)控多個(gè)下游關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活、增殖、生長和細(xì)胞代謝通路的改變[28]。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，利用RNAscope原位雜交技術(shù)檢測的FGFBP2 mRNA表達(dá)有潛力作為食管癌患者的預(yù)后判斷分子標(biāo)志物。同時(shí)，本研究揭示了FGFBP2通過AKT信號(hào)通路對食管癌細(xì)胞增殖的作用，為進(jìn)一步深入研究食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。