高原型青海藏羊超數(shù)排卵效果分析

文│隋鶴鳴 孟飛 許海濤 朱芳賢（全國(guó)畜牧總站）

莫延新 謝秀梅（青海省家畜改良中心）

高原型青海藏羊是經(jīng)過(guò)青藏高原牧民長(zhǎng)期選育的特色地方品種山羊。此品種適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、耐粗飼而且肉質(zhì)優(yōu)良，是當(dāng)?shù)厝忸?lèi)主要來(lái)源。為了避免在未來(lái)發(fā)展過(guò)程中，出現(xiàn)雜交、近交、環(huán)境變化等造成的優(yōu)良基因流失問(wèn)題，開(kāi)展了青海良種高原型青海藏羊保種胚胎收集保存工作。冷凍胚胎保存可以保存品種個(gè)體的全部基因。胚胎細(xì)胞可以長(zhǎng)期存活于超低溫條件，可以通過(guò)胚胎移植和核移植技術(shù)恢復(fù)遺傳資源，因此，在保護(hù)動(dòng)物遺傳資源，尤其是挽救瀕危動(dòng)物方面，冷凍胚胎技術(shù)發(fā)揮了重要的作用。

一、材料與方法

1.供體羊。從主產(chǎn)區(qū)挑選純種12～36月齡高原型青海藏羊在青海省家畜改良中心西寧示范基地開(kāi)展。

2.主要藥品與器械。日本（JP）FSH（促卵泡素），10AU×5支；加拿大（CAN）Follitropin FSH，每支400毫克；氯前列烯醇（PG），每支0.2毫克/2毫升；促黃體素釋放激素A3（促排3號(hào)），20微克×10支；普魯卡因每支40毫克/2毫升；黃體酮陰道緩釋劑（CIDR），每支1.9克。

羊用二通式?jīng)_卵管、滯留針、集卵杯、手術(shù)器械、恒溫水浴鍋、體視顯微鏡、自制手術(shù)保定架。

3.供體超數(shù)排卵處理方案。供體超數(shù)排卵處理方案見(jiàn)表1，各試驗(yàn)組埋置CIDR和配種后各注射維生素ADE注射液3毫升和促排3號(hào)3/4支。

4.供體羊配種。觀察到第1次發(fā)情12小時(shí)后配種，之后間隔10～12小時(shí)再配一次，連續(xù)配種2～3次。

5.胚胎的采集與質(zhì)量鑒定。以發(fā)情日為第0天，第7天采用手術(shù)法回收胚胎。用含1%血清的杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗兩側(cè)子宮角，每側(cè)用液20毫升。子宮回流液靜置3分鐘，在顯微鏡下?lián)斐雎炎?，并保存在保存液中。根?jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胚胎分級(jí)，通常有用胚胎或可移胚胎包括A、B、C級(jí)胚胎，根據(jù)保種需要，本文中有效胚胎為A、B級(jí)胚胎。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：

A級(jí)：胚胎形態(tài)完整，輪廓清晰，呈球形，分裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊，色調(diào)和透明度適中，無(wú)附著的細(xì)胞和液泡，變性細(xì)胞少于15%。

B級(jí)：輪廓清晰，色調(diào)及細(xì)胞密度良好，可見(jiàn)到少量附著的細(xì)胞和液泡，變性細(xì)胞少于50%。

C級(jí)：輪廓不清晰，色調(diào)發(fā)暗，結(jié)構(gòu)較松散，游離的細(xì)胞或液泡較多，變性細(xì)胞少于75%。

D級(jí)：凡在16細(xì)胞以下的受精卵，或有碎片、輪廓不清晰、結(jié)構(gòu)松散、變性細(xì)胞達(dá)75%以上都屬于D級(jí)。

6.數(shù)據(jù)處理。采用SPSS 17.0軟件試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。超數(shù)排卵有效但沖卵失敗的個(gè)體不計(jì)入數(shù)據(jù)分析。

二、結(jié)果與分析

1.高寒地區(qū)高原型青海藏羊超數(shù)排卵效果。超數(shù)排卵處理37只高原型青海藏羊，有效沖胚34只，結(jié)果表明為只均黃體數(shù)7.84個(gè)，只均獲有效胚3.43 枚。

2.日本FSH不同劑量超數(shù)排卵效果的比較。日本FSH不同劑量超數(shù)排卵效果見(jiàn)表2，日本FSH不同注射量中Ⅱ組（20.0AU）效果最佳，只均黃體數(shù)、只均回收卵數(shù)、卵子回收率、只均有效胚數(shù)、有效胚率（有效胚占回收卵的比例）、受精率分別為5.94個(gè)、4.06個(gè)、68%、2.33枚、57%和85%。Ⅰ組只均黃體數(shù)、只均回收卵數(shù)、卵子回收率、只均有效胚數(shù)、有效胚率高于Ⅱ組（P＞0.05），但由于其參試供體少，我們認(rèn)為效果總體評(píng)價(jià)不如Ⅱ組。Ⅲ組只均黃體數(shù)、只均回收卵數(shù)、卵子回收率高于Ⅱ組（P＞0.05），但只均有效胚數(shù)、有效胚率低于Ⅱ組（P＜0.05），受精率也低于Ⅱ組（P＞0.05）。

表1 超數(shù)排卵處理方案

3.加拿大FSH不同劑量超數(shù)排卵效果的比較。加拿大FSH不同劑量超數(shù)排卵效果見(jiàn)表3，加拿大FSH不同注射量中Ⅱ組（240毫克）效果最佳，只均黃體數(shù)、只均回收卵數(shù)、卵子回收率、只均有效胚數(shù)、有效胚率、受精率分別為10.33個(gè)、8.33個(gè)、81%、5.67枚、68%和79%。Ⅰ組卵子回收率、有效胚率、受精率高于Ⅱ組（P＞0.05），但只均黃體數(shù)、只均回收卵數(shù)、只均有效胚數(shù)低于Ⅱ組（P＞0.05），我們認(rèn)為效果總體評(píng)價(jià)不如Ⅱ組。Ⅲ組只均黃體數(shù)高于Ⅱ組（P＞0.05），但只均回收卵數(shù)、卵子回收率、只均有效胚數(shù)、有效胚率低于Ⅱ組（P＞0.05），受精率顯著低于Ⅱ組（P＜0.05）。

4.不同品牌F S H超數(shù)排卵效果的比較。不同品牌F S H超數(shù)排卵效果見(jiàn)表4，比較了效果最佳的日本FSH20.0AU組與加拿大FSH240毫克組，加拿大FSH只均黃體數(shù)、只均回收卵數(shù)、卵子回收率、只均有效胚數(shù)、有效胚率都顯著高于日本FSH（P＜0.05），只有受精率低于日本產(chǎn)FSH（P＞0.05），此次試驗(yàn)中加拿大FSH效果優(yōu)于日本FSH。

表2 日本FSH不同劑量超數(shù)排卵效果的比較

三、討論

1.高寒地區(qū)高原型青海藏羊超數(shù)排卵效果分析。超數(shù)排卵對(duì)于供體來(lái)說(shuō)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，超數(shù)排卵處理方法要根據(jù)供體本身激素水平的變化而設(shè)計(jì)，但因不同品種、不同個(gè)體、不同藥品和不同生長(zhǎng)環(huán)境，其處理方法也不相同，超數(shù)排卵結(jié)果也不一樣。朱士恩總結(jié)了我國(guó)2010年以前綿羊超數(shù)排卵結(jié)果發(fā)現(xiàn)，美利奴超細(xì)毛羊超數(shù)排卵獲得可移植胚胎數(shù)量平均為5.83～6.56枚/次，肉用綿羊?yàn)?.98～9.77枚/次。但有關(guān)地方品種綿羊超數(shù)排卵的報(bào)道少，尤其是高海拔、高寒地區(qū)。

由于生態(tài)環(huán)境和品種的差異，超數(shù)排卵結(jié)果差異也很大，朱芳賢等（2014）報(bào)道蘭州大尾羊獲得A級(jí)胚胎平均為5.0枚/次。此次試驗(yàn)只均黃體數(shù)只有7.84個(gè)，只均獲有效胚只有3.43枚，可能原因，一是高寒地區(qū)藏羊繁殖率低，母羊一般年產(chǎn)一胎，一胎一羔，產(chǎn)雙羔者很少。二是此實(shí)驗(yàn)供體羊都是放牧，超數(shù)排卵處理過(guò)程中應(yīng)激大，影響超排效果，最明顯的影響是試情時(shí)躲閃，無(wú)法判斷準(zhǔn)確發(fā)情時(shí)間。配種時(shí)不穩(wěn)，精液不到生殖道或到的少。三是供體羊有的剽悍，采食過(guò)多，群體中肥瘦分化大。建議馴養(yǎng)一段時(shí)間后開(kāi)展超數(shù)排卵工作，同時(shí)注意分群飼養(yǎng)。

2.FSH不同劑量超數(shù)排卵效果的比較。適宜的FSH劑量是取得好的超數(shù)排卵效果的關(guān)鍵因素之一。較大的劑量造成較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)，劉廣振認(rèn)為較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)使得部分個(gè)體優(yōu)勢(shì)卵泡排卵過(guò)早，黃體功能不全，分泌孕酮水平較低，從而造成胚胎退化。譚景和等、范必勤等也認(rèn)為較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)使得卵巢過(guò)度增大，卵泡過(guò)度增多，可能卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，排卵后卵子未進(jìn)入輸卵管中而直接掉入腹腔，最終卵子回收率低，未受精卵多，可用胚率也很低，A、B級(jí)胚胎更少。本次試驗(yàn)中日本FSH大劑量24.0AU組、加拿大FSH劑量280毫克組都是卵泡發(fā)育多，但回收到的卵子少，尤其是有效胚胎少，可能卵子質(zhì)量差，造成受精率低和胚胎退化的多。本次試驗(yàn)證實(shí)了以上說(shuō)法，同時(shí)也說(shuō)明，高原型青海藏羊適宜FSH劑量為20.0AU的日本FSH和240毫克的加拿大FSH。

3.不同品牌FSH超數(shù)排卵效果的比較。超數(shù)排卵是應(yīng)用不同品牌、不同批次的激素也是影響超數(shù)排卵效果的主要因素之一。桑潤(rùn)滋等認(rèn)為，不同品牌、不同批次的激素是存在質(zhì)量差異和效價(jià)不穩(wěn)定等因素，純度及所含促黃體素（LH）活性成分的多少，以及用于不同品種、不同個(gè)體超數(shù)排卵效果也不相同。本次試驗(yàn)中加拿大FSH超數(shù)排卵效果優(yōu)于日本產(chǎn)FSH，說(shuō)明加拿大FSH更適合高原型青海藏羊，但造成這樣的原因可能是不在同一期進(jìn)行，受營(yíng)養(yǎng)等因素影響，建議大規(guī)模進(jìn)行超數(shù)排卵前有必要做些預(yù)試驗(yàn)。

四、小結(jié)

本試驗(yàn)超數(shù)排卵處理37只高原型青海藏羊，結(jié)果表明：只均黃體數(shù)7.84個(gè)，只均獲有效胚3.43枚，同時(shí)也表明，日本FSH的適宜劑量為20.0AU，只均黃體數(shù)5.94個(gè)，只均獲有效胚2.33枚；加拿大FSH的適宜劑量為240毫克，只均黃體數(shù)10.33個(gè)，只均獲有效胚5.67枚；加拿大產(chǎn)FSH效果優(yōu)于日本產(chǎn)FSH，差異顯著，說(shuō)明加拿大FSH更適合高原型青海藏羊，同時(shí)建議大規(guī)模進(jìn)行超數(shù)排卵前有必要做些預(yù)試驗(yàn)。

表3 加拿大產(chǎn)FSH不同劑量超數(shù)排卵效果的比較

表4 不同品牌FSH超數(shù)排卵效果的比較