IRP患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CD28/B7家族共刺激分子mRNA表達(dá)研究

陳龍 范麗萍 張永為 王劍超

免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少癥（immune- related pancytopenia，IRP）是近年來新認(rèn)知的一類骨髓衰竭性疾病，臨床上常表現(xiàn)為二系或二系以上的血細(xì)胞減少，但其不同于其它已經(jīng)認(rèn)知的骨髓衰竭性疾病，IRP 主要特征是由于骨髓造血細(xì)胞表面產(chǎn)生了自身抗體，影響了造血細(xì)胞的分化發(fā)育，從而引起外周血細(xì)胞減少。該類患者外周血抗人球蛋白試驗(yàn)（COOMBS試驗(yàn)）呈陰性，但骨髓單個(gè)核細(xì)胞 COOMBS 試驗(yàn)或流式細(xì)胞技術(shù)均能檢測(cè)到造血細(xì)胞自身抗體的存在。國(guó)內(nèi)許多學(xué)者已對(duì)IRP疾病發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了初步研究［1］，發(fā)現(xiàn)IRP患者的B淋巴細(xì)胞數(shù)量、亞群、功能存在異常，尤其當(dāng)T細(xì)胞活化異常介導(dǎo)的 B1群（CD5+的B細(xì)胞）數(shù)量增多，功能亢進(jìn)可能是產(chǎn)生抗骨髓未成熟造血細(xì)胞自身抗體的主要原因［2-3］，但影響T細(xì)胞活化和分化的 CD28/B7 家族共刺激分子在IRP中是否存在表達(dá)異常尚不明確，有必要進(jìn)一步分析討論。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集本院2010年10月至2016年10月間門診和住院患者確診為IRP患者骨髓樣本20例及20例陰性對(duì)照骨髓樣本，考慮到臨床可行性和較易獲取可能性，擬采用診斷為缺鐵性貧血（IDA）患者骨髓樣本20例作為陰性參照（IDA是一種單純的缺鐵性貧血，其生理生化性質(zhì)與正常人基本相同）。40例樣本均來自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科收治并經(jīng)臨床確診患者，年齡33～82歲，中位年齡58歲，男女比3∶2，患者本身無嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，所有樣本采集均征得患者本人同意下獲得。IRP患者入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者外周血呈一系、二系或全血細(xì)胞減少；（2）患者骨髓中紅系細(xì)胞比例不低，或骨髓象可見“紅系造血島”；（3）能夠明確獨(dú)立不同于其他各類血液或骨髓衰竭疾??；（4）骨髓單個(gè)核細(xì)胞 Coomb's 試驗(yàn)陽(yáng)性；（5）臨床免疫抑制療法對(duì)其有效。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Ficoll 密度梯度離心液、Trizol 試劑盒、氯仿、無水乙醇、DEPC 水、TaqDNA 聚合酶、PrimeScript TMΠ 1st-strand cDNA Synthesis kit、SYBR Green Master kit、β-action 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、5× Reverse Tan-scriptase M-MLV Buffer 、10x 細(xì)胞裂解液、CTLA-4'CD28'CD80'CD86mRNA 探針及引物合成、RPMI1640培養(yǎng)液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法與觀察指標(biāo) 40例骨髓樣本均采用EDTA抗凝管采樣2ml，用30μm尼龍濾網(wǎng)過濾掉骨髓中的細(xì)胞團(tuán)塊及凝塊，然后采用 Ficoll 密度梯度離心法分離BM-MNCs，將各組分離出來單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，然后用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，將40例骨髓樣本中單個(gè)核細(xì)胞處于同一細(xì)胞濃度約3×104/μl，然后每個(gè)樣本各取200μl按Trizol 試劑說明書操作過程提取每個(gè)樣本的總 RNA，按 RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，cDNA 樣本-80℃保存。設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行目標(biāo)基因的循環(huán)擴(kuò)增指標(biāo)檢測(cè)。采用 RTPCR 擴(kuò)增儀分析軟件，以空白對(duì)照作為標(biāo)準(zhǔn)基線，參考標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)濃度形成的擴(kuò)增曲線來?yè)Q算待測(cè)樣本中每個(gè)目的基因的表達(dá)含量，采用相對(duì)定量的方法，用內(nèi)參基因（actin-β）將目的基因（CTLA-4，CD28，CD80，CD86）校正至 108copies/ml，用目的基因校正值的拷貝數(shù)取對(duì)數(shù)值為最終有效數(shù)據(jù)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

IRP患者組和IDA對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CTLA-4、CD28、CD80、CD86mRNA表達(dá)見表1。

表1 IRP和IDA骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CD28/B7家族共刺激分子mRNA的表達(dá)［copies/ml，（x±s）］

3 討論

目前認(rèn)為IRP作為一類骨髓方面的血液系統(tǒng)疾病，其主要特點(diǎn)是此類疾病患者的骨髓造血細(xì)胞表面存在自身抗體（而在外周血中細(xì)胞表面未檢測(cè)到自身抗體），骨髓造血細(xì)胞表面的自身抗體在髓內(nèi)直接引起破壞或抑制造血細(xì)胞，導(dǎo)致骨髓造血功能減退或無效造血，從而引起患者外周血中全血或二系細(xì)胞減少，關(guān)于IRP的發(fā)病機(jī)制的研究，目前主要的研究認(rèn)為IRP是由于T淋巴細(xì)胞（TH）調(diào)控失衡導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞（CD5+）數(shù)量、亞群、功能異常，從而引起患者骨髓中免疫調(diào)節(jié)紊亂，免疫平衡破壞，骨髓中造血前體血細(xì)胞表面抗原簇結(jié)合相關(guān)自身抗體，繼而被吞噬破壞、凋亡，造血細(xì)胞數(shù)量急劇下降，長(zhǎng)此以往，最終引起患者外周血中血細(xì)胞減少［4］。雖然有關(guān)于T細(xì)胞調(diào)節(jié)失衡引發(fā)B細(xì)胞增殖活化異常，最終導(dǎo)致自身相關(guān)性抗體產(chǎn)生是IRP的主要可能的發(fā)病機(jī)制，但是有關(guān)于IRP中T細(xì)胞的增殖活化調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚，未見相關(guān)的報(bào)道。

CTLA-4/CD28-B7共刺激通路是T細(xì)胞活化的上游調(diào)控機(jī)制，是其活化過程中必不可少的刺激信號(hào)［5-6］，因此，通過研究CTLA-4/CD28 -B7共刺激通路對(duì)T細(xì)胞增殖分化的影響，能夠幫助我們對(duì)IRP發(fā)病機(jī)制有更進(jìn)一步的了解。本實(shí)驗(yàn)將共刺激分子CTLA-4、CD28、CD80及CD86作為研究目標(biāo)，通過研究IRP患者骨髓造血細(xì)胞中CTLA-4、CD28、CD80及CD86四類共刺激分子的mRNA表達(dá)，來了解共刺激通路與IRP發(fā)病機(jī)制及其對(duì)T細(xì)胞調(diào)控間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)IRP患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CD28/B7家族共刺激分子mRNA存在異常表達(dá)，具體表現(xiàn)為CTLA-4mRNA表達(dá)明顯下降，CD28及CD80/CD86雖有下調(diào)但是較前者不明顯，CTLA-4在共刺激通路中占主導(dǎo)地位，CTLA-4mRNA表達(dá)下降可能導(dǎo)致T細(xì)胞增殖過度活化（尤其是TH2細(xì)胞），導(dǎo)致TH1/TH2比例倒置，TH1細(xì)胞功能受抑制，TH2細(xì)胞功能亢進(jìn)，分泌大量正性刺激因子促進(jìn)B細(xì)胞活化增殖，抑制B細(xì)胞凋亡，可能導(dǎo)致CD5+B1群細(xì)胞過度活化，而CD5+B1群細(xì)胞與產(chǎn)生自身抗體有關(guān)，最終導(dǎo)致骨髓造血細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體，引起外周血細(xì)胞減少。作者從 CTLA-4/CD28/B7共刺激通路角度，為臨床進(jìn)一步了解 IRP 發(fā)病機(jī)制提供了新的思路和方向。