基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的作用機(jī)制研究

章水晶 舒馨馨 杜仲燕

帕金森病是繼阿爾茲海默病之后的第二大類神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，為一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。目前我國發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已有大約200萬PD患者［2］，預(yù)計至2030年帕金森病患者將達(dá)500萬人［3］。迄今為止，尚無有效而又安全的藥物，以復(fù)方左旋多巴為代表的藥物是目前治療帕金森病最基礎(chǔ)的口服藥物，但長期服用左旋多巴替代療效有限［4］，不能有效阻止病情的發(fā)展。近年大量研究表明，中醫(yī)中藥能有效改善患者臨床癥狀，不良反應(yīng)較少，逐漸成為研究的重點和熱點［5］。帕金森病的主要病機(jī)是氣血虧虛、肝腎陰虛、夾風(fēng)火痰瘀［6］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對補(bǔ)陽還五湯多成分、多靶點與帕金森病的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系進(jìn)行研究，旨在為揭示補(bǔ)陽還五湯作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)陽還五湯所含化學(xué)成分的收集與處理 本研究采用中藥分子作用機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batmantcm/），以HUANG QI、TAO REN、HONG HUA、CHI SHAO、CHUAN XIONG、DANG GUI、DI LONG為關(guān)鍵詞，檢索補(bǔ)陽還五湯的全部化學(xué)成分。

1.2 預(yù)測靶標(biāo)基因 靶標(biāo)基因預(yù)測通過計算“入血化合物-靶標(biāo)”與“已知藥物-靶標(biāo)”之間的相似性得分（score）獲得，在BATMAN-TCM平臺中設(shè)置以score≥20的靶標(biāo)作為化合物的靶標(biāo)基因。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建 為說明靶點蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的相關(guān)作用靶點上傳至在線STRING軟件（http：//string-db.org）。

1.4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 根據(jù)上述預(yù)測結(jié)果，使用Cytoscape軟件中的關(guān)聯(lián)功能（Merge）將篩選出的活性成分、潛在靶點以及與靶點對應(yīng)的疾病信息構(gòu)建一個藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。在生成的網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點代表化合物、蛋白質(zhì)或疾病，邊代表化合物-靶點以及靶點-疾病相互作用。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的靶點篩選 檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的靶點共18個，如表1所示為補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病對應(yīng)靶點，與帕金森病經(jīng)典通路基本吻合（P＜0.05）。

表1 補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病對應(yīng)靶點（score≥20）

2.2 補(bǔ)陽還五湯的活性成分篩選 通過BATMANTCM數(shù)據(jù)庫中整理出補(bǔ)陽還五湯中共454個化合物，手動篩選補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的靶點對應(yīng)的成分共201個。如表2所示，其中若一個靶點對應(yīng)＞3個靶成分下表只則列出前3個成分，其中主要涉及了百里香酚、十五烷醇、癸酸等（P＜0.05）。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了更好地理解補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的作用機(jī)制，基于PPI關(guān)系，利用STRING軟件構(gòu)建了補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖1。PPI網(wǎng)絡(luò)包含18個蛋白質(zhì)節(jié)點，22條相互作用關(guān)系（連線），其中3個蛋白質(zhì)節(jié)點無相互作用關(guān)系。

圖1 補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 使用Cytoscape軟件構(gòu)建在帕金森病方向補(bǔ)陽還五湯活性成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)模型，如圖2所示。從圖中可以看出，111個活性成分的15個潛在靶點對比到帕金森病上，不同的活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，充分體現(xiàn)了補(bǔ)陽還五湯多成分、多靶點的作用機(jī)制。

圖2 補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的靶點-成分網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表2 補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病靶點對應(yīng)成分（score≥20）

2.5 候選靶標(biāo)基因功能分析 根據(jù)補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病相關(guān)的靶基因，對候選靶標(biāo)進(jìn)行基因分析，得到候選靶標(biāo)具有的功能信息，按P值選取了前10，見表3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其功能涉及小分子代謝過程、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、氧化還原酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、轉(zhuǎn)運、恒定作用等。

表3 補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病候選靶標(biāo)參與的基因功能信息

3 討論

補(bǔ)陽還五湯來源于清代名醫(yī)王清任的著作《醫(yī)林改錯》，王氏認(rèn)為：“元氣既虛，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”，該方由補(bǔ)氣藥與活血化瘀藥相配伍，由黃芪、桃仁、紅花、赤芍、川芎、當(dāng)歸、地龍等7味藥材組成。方中重用黃芪為君藥，大補(bǔ)脾胃中氣以資化源，固攝經(jīng)絡(luò)真氣以節(jié)散流，使氣旺則血行，祛瘀而不傷正。當(dāng)歸為臣藥，長于活血，兼能養(yǎng)血，有化瘀而不傷血之妙。川芎、赤芍、桃仁、紅花為佐藥，助當(dāng)歸活血化瘀以治標(biāo)。更佐地龍與生黃芪配合，增強(qiáng)補(bǔ)氣通絡(luò)之力，使藥力能周行全身。諸藥合用具有補(bǔ)氣、活血和通絡(luò)3個方面的功效。補(bǔ)陽還五湯古代主要用于治療中風(fēng)、半身不遂、口眼歪斜、語言謇澀、口角流涎、大便干燥、小便頻數(shù)和遺尿不禁等［7］，現(xiàn)代臨床廣泛用于治療腦梗死、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，療效顯著。彭根興等［8］研究得出結(jié)論：補(bǔ)陽還五湯對帕金森病臨床療效顯著。但由于中藥復(fù)方化學(xué)成分的復(fù)雜性和功能主治的多樣性，補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為中藥研究的學(xué)科前沿，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容［9］，主要包括活性成分的篩選、作用靶點的獲取、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析3個部分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建活性成分-靶點、靶點-靶點、成分-靶點-疾病、成分-靶點-通路等網(wǎng)絡(luò)，充分利用基因、靶點等大數(shù)據(jù)，系統(tǒng)綜合地來闡明藥物的作用機(jī)制，非常適合于多成分、多靶點的中藥復(fù)方作用機(jī)制的研究［10-11］。與基礎(chǔ)藥理學(xué)最大的不同在于，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是緊密結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)與生物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析等來闡釋藥效、藥物毒性及代謝特點，是從整體觀的角度認(rèn)識藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)。

中醫(yī)藥有著幾千年的歷史，蘊(yùn)藏著巨大的新藥創(chuàng)制資源，是未來個體化醫(yī)療發(fā)展、多靶點藥物發(fā)現(xiàn)的源泉。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，從而揭示藥物協(xié)同作用于人體的奧秘。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略符合中醫(yī)藥學(xué)對疾病整體性的認(rèn)識，既體現(xiàn)前沿科技的特點，又適于結(jié)合中醫(yī)藥核心理論，有利于篩選中藥的有效成分及闡釋中藥的作用機(jī)制，有利于發(fā)現(xiàn)中藥的組效關(guān)系及其方劑配伍規(guī)律，有利于為中醫(yī)藥的創(chuàng)新發(fā)展提供新的科學(xué)依據(jù)，有助于中藥的新藥創(chuàng)制［12］。

本研究采用BATMAN-TCM平臺篩選出補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的活性成分111個，百里香酚、十五烷醇、癸酸、欖香烯、香葦醇乙酸酯、月桂烯、甲酚等成分直接、間接地作用于多種神經(jīng)遞質(zhì)，包括乙酰膽堿酯酶、載脂蛋白e、丁酰膽堿酯酶、緩激肽B2受體、羧酸酯酶1、膽堿能受體1等，涉及小分子代謝過程、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、氧化還原酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等GO生物過程子簇。乙酰膽堿酯酶、載脂蛋白e等靶點可能是導(dǎo)致帕金森病的主要原因［13］，由此推測補(bǔ)陽還五湯主要通過作用上述受體及對應(yīng)信號通路來治療帕金森病。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略對補(bǔ)陽還五湯進(jìn)行化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫構(gòu)建、靶點預(yù)測、藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析并，分析了GO生物過程，初步闡明了補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的作用機(jī)制，對全面、深入研究補(bǔ)陽還五湯治療帕金森病的作用機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。中醫(yī)藥的研究隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在數(shù)據(jù)積累、計算與實驗方法的深入交叉、各種組學(xué)技術(shù)以及高內(nèi)涵/高通量技術(shù)的發(fā)展，便于其從整體的角度，用在線構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的方法研究中藥分子基礎(chǔ)及多靶點、多途徑的協(xié)同作用，并用網(wǎng)絡(luò)的形式直觀地呈現(xiàn)出來，這種研究方法為傳統(tǒng)中藥的發(fā)展及中藥新藥的開發(fā)提供了有力支撐。