5種市售楓槭浸膏揮發(fā)性成分的HS-SPME-GC/MS分析

蔡莉莉，柴國璧，王 東，羅燦選，張啟東，趙志偉*，劉前進，席高磊，郝 輝，孫志濤，陳芝飛*

1.河南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，鄭州經濟技術開發(fā)區(qū)第三大街8號 450016

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

楓槭浸膏是國家標準 GB 2760—2014［1］允許使用的一種食品用天然香料，也是一種重要的煙草添加劑。楓槭浸膏具有強烈的焦糖香氣，其在卷煙中應用時不僅可賦予卷煙焦甜香、烘烤香等香韻，而且可以改善余味，減少雜氣和刺激性。然而，目前國內外研究主要集中在楓糖化學成分分析，未見楓槭浸膏化學成分的相關研究報道［2-5］。因此，研究楓槭浸膏的成分組成特征對于指導其在卷煙中的應用具有重要意義。頂空固相微萃取（Headspace Solid-Phase Microextraction，HS-SPME）是將吸附涂層（萃取纖維頭）暴露在樣品上方富集待測組分的方法，是固相微萃取的一種萃取方式。與水蒸氣蒸餾、同時蒸餾萃取、溶劑萃取等方法相比，HS-SPME 操作簡單、靈敏度高、樣品用量少，目標成分的采集、萃取、濃縮操作可一步完成，且在樣品制備過程無需有機溶劑。該方法可有效消減樣品基質干擾，并且能與GC/MS 方法直接聯(lián)用。目前，HS-SPME 已廣泛應用于不同樣品中揮發(fā)性成分的分析研究［6-10］。因此，本研究中通過對SPME 萃取纖維頭和萃取條件進行考察，建立楓槭浸膏揮發(fā)性成分的HS-SPME-GC/MS 方法，并對不同楓槭浸膏揮發(fā)性成分進行分析，比較其揮發(fā)性成分差異，旨在闡明楓槭浸膏香氣成分的化學組成，為楓槭浸膏在煙草工業(yè)領域中的應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

楓槭浸膏DP、XH、W、GZ、AP 均為市售產品，由河南中煙工業(yè)有限責任公司提供。氯化鈉（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；C7～C40正構烷烴混合標樣（1 mg/L，美國Supelco 公司）；二氯甲烷（色譜純）及丙酸蘇合香酯標準品（≥98%，美國Sigma-Aldrich 公司）。

7890A/5977C 型氣相色譜/質譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；SPME 手柄、SPME 萃取纖維頭（具體參數見表1）及SPME 進樣口導向器（美國Supelco 公司）；40 mL 帶橡膠墊螺紋頂空進樣玻璃瓶（美國 CNW 公司）；CP2245 電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 公司）；HH-S1 型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 楓槭浸膏的嗅香評價

參考 YC/T 497—2014［11］中的嗅香評價方法，結合煙用香料實際情況，選取16 種常用香韻（樹脂香、干草香、清香、果香、辛香、木香、青滋香、花香、藥草香、豆香、可可香、奶香、膏香、烘焙香、焦香和甜香）對5 種楓槭浸膏樣品進行嗅香評價，量化分值為0～5 分，記分單位為0.5 分。在剔除離群值后，通過計算平均值確定樣品各個香韻的分值。嗅香評價的評委均具備國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心頒發(fā)的卷煙感官評吸資質，評委數量為7 人。

表1 SPME 萃取纖維頭及活化條件Tab.1 Extraction fibers and activation conditions of SPME

1.2.2 楓槭浸膏的HS-SPME-GC/MS 分析

稱取約0.007 0 g（精確至0.000 1 g）楓槭浸膏置于頂空瓶中，加入10 μL 2.48 mg/L 丙酸蘇合香酯（內標）溶液和0.5 mL 5 mol/L 氯化鈉水溶液，搖勻；置于60 ℃水浴中，插入SPME 萃取纖維頭（使用前需活化，活化條件見表1）吸附50 min；將萃取纖維頭在GC/MS 進樣口（溫度250 ℃）解吸附4 min，然后分別采用 HP-INNOWAX 和 DB-5MS 兩種不同極性的色譜柱進行GC/MS 分析。GC/MS分析條件為：

色譜柱1：HP-INNOWAX 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：He；流量：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：手動模式，不分流進樣；溶劑延遲：4 min；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持 4 min，以 2 ℃/min 升溫至 230 ℃，保持 10 min；離子源溫度：230 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；質量掃描范圍：50～500 amu。

色譜柱2：DB-5MS 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：He；流量：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：手動模式，不分流進樣；溶劑延遲：4 min；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持4 min，以 2 ℃/min 升溫至 230 ℃，保持 10 min；離子源溫度：230 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：260 ℃；質量掃描范圍：50～500 amu。

1.2.3 楓槭浸膏揮發(fā)性成分的定性分析

借助NIST 和Wiley 庫標準質譜圖比對（匹配度≥85%）、保留指數（Retention time index，RI）比對進行化合物定性分析。其中，RI 根據改進的Kovats 法計算得到，具體操作為：將10 μL 1 mg/L C7～C40正構烷烴混合標樣加入樣品中，混合均勻后進行HS-SPME-GC/MS 分析，依據化合物和正構烷烴的色譜保留時間，采用公式（1）進行計算RI。

式中：tR—目標組分流出峰的保留時間，min；tn、tn+1—碳原子數為n 和n+1 的正烷烴流出峰的保留時間，min。tn＜tR＜tn+1。

1.2.4 數據處理

采用SPSS18.0 和PAST3 軟件分別進行單因素方差分析(One-way AVONA) 和主成分分析(Principle Component Analysis，PCA)。

2 結果與討論

2.1 嗅香評價結果分析

為了明確5 種楓槭浸膏樣品的感官特征，采用香氣輪廓分析法對5 種樣品的嗅香進行了評價分析，結果見圖1。從圖1 可以看出，5 種樣品的主香韻較為一致，同時在其他香韻上又存在一定差異。5 種樣品的焦香、甜香和烘焙香均較為突出；樣品DP、XH 和W 的感官特征較為類似，除3 種主要香韻外可可香和奶香也相對強烈；樣品AP 則表現(xiàn)出較強烈的膏香；樣品GZ 的辛香和果香較其他4 種樣品更為明顯。

圖1 5 種楓槭浸膏樣品的嗅香評價結果Fig.1 Olfactory sensory evaluation of 5 maple concrete samples

2.2 HS-SPME條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取纖維頭的選擇

在萃取溫度50 ℃、萃取時間30 min、解吸溫度250 ℃、解吸時間4 min 條件下，對 100 μm PDMS、75 μm Carboxen/PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm PA 和 60 μm PEG等6 種極性不同的SPME 萃取纖維頭（表1）進行考察，分析其對楓槭浸膏揮發(fā)性成分的萃取效率。6種SPME 萃取纖維頭的GC/MS 總離子流圖和不同種類化合物色譜圖峰面積分別見圖2 和圖3。

圖2 不同SPME 萃取纖維頭GC/MS 總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms by GC/MS with different SPME fibers

圖3 不同種類化合物色譜圖的峰面積Fig.3 Chromatographic peek areas of different types of compounds

由圖3 可知，采用6 種不同SPME 萃取纖維頭檢出的揮發(fā)性成分在種類和數量上有較大差異。其中，采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭檢出的揮發(fā)性成分種類和數量較多，且揮發(fā)性成分色譜峰總面積最大，說明其對碳氫化合物、醛酮類、醇醚類、酯類（內酯）、酸類以及雜環(huán)類均具有較好萃取效果。因此，選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭。

2.2.2 萃取溫度的確定

采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纖維頭，固定萃取時間30 min、解吸溫度250 ℃、解吸時間4 min，考察不同萃取溫度(30、40、50、60 和 70 ℃)對萃取效率的影響，結果見圖4。由圖4 可知，當溫度從30 ℃升至60 ℃時，萃取效率呈上升趨勢，60 ℃時萃取成分的總峰面積最大，當溫度高于60 ℃時，各類化合物峰面積增加不明顯。因此，確定萃取溫度為60 ℃。

圖4 萃取溫度對萃取效率的影響Fig.4 Influence of extraction temperature on extraction efficiency

2.2.3 萃取時間的確定

采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纖維頭，固定萃取溫度60 ℃、解吸溫度250 ℃、解吸時間4 min，考察不同萃取時間(20、30、40、50、60 和 70 min)對萃取效率影響，結果見圖5。由圖5 可知，隨著萃取時間的延長，萃取的各類化合物總量逐漸增加，50 min 后趨于穩(wěn)定，表明樣品基質、頂空和SPME 之間已經達到動態(tài)平衡。因此，確定萃取時間為50 min。

圖5 萃取時間對萃取效率的影響Fig.5 Influence of extraction time on extraction efficiency

2.2.4 解吸時間的確定

采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纖維頭，固定萃取溫度60 ℃、萃取時間50 min、解吸溫度250 ℃，考察不同解吸時間(2、3、4、5 和6 min)對解吸效果的影響，結果見圖6。由圖6 可知，隨著解吸時間的延長，解吸效率呈增大趨勢；當解吸時間達到4 min 時，萃取的化合物已基本實現(xiàn)熱脫附。因此，確定解吸時間為4 min。

圖6 解吸時間對萃取效率的影響Fig.6 Influence of desorption time on extraction efficiency

2.3 楓槭浸膏揮發(fā)性成分的定性分析

為了提高定性結果的準確性，首先通過HP-INNOWAX 色譜柱對樣品進行分析，結合標準質譜圖比對和保留指數初步定性，再采用DB-5MS色譜柱進行分析，利用該色譜柱上的保留指數對定性結果進一步驗證。DP、XH、W、GZ、AP 等5 種市售楓槭浸膏樣品的定性分析結果見圖7 和表2。

由表2 可知：①從5 種楓槭浸膏中共鑒定出104 種揮發(fā)性成分，主要為碳氫化合物、醛酮類、酯類（含內酯）、醇醚類、有機酸類、雜環(huán)類和酚類物質；不同市售楓槭浸膏的揮發(fā)性成分差異較大，其中，浸膏 DP 為 41 種，XH 為 48 種，W 為 42 種，GZ為 79 種，AP 為 36 種。②104 種揮發(fā)性成分中，文獻報道具有香氣特征的揮發(fā)性成分為79 種；16 種揮發(fā)性成分（柏木烯、1-苯基-1-戊酮、十五酸乙酯、棕櫚酸甲酯、對乙基苯乙酮、肉豆蔻醚、9-十六碳烯酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚、洋芹腦、十七烷酸乙酯、丁烯基苯酞、藁本內酯、4-甲基二苯甲酮、亞麻酸乙酯、3-羥基苯乙酮和間羥基苯甲醛）的香氣特征盡管沒有文獻記載，但其結構類似的化合物均表現(xiàn)出特定的香氣，如4-甲基二苯甲酮和二苯甲酮均呈現(xiàn)淡弱帶青澀的甜香、似玫瑰香葉香氣［12-13］，由此可推測這16 種揮發(fā)性成分也具有類似的香氣特征。因此，通過HS-SPME-GC/MS 檢測到95 種香氣成分，占揮發(fā)性成分總數91.3%。③5種楓槭浸膏的共有香氣成分為11 種（5-甲基糠醛、麥芽酚、2-乙?；秽?、2，6-二甲基吡嗪、苯甲醛、愈創(chuàng)木酚、丁酸苯甲酯、對乙基苯乙酮、苯甲酸、香蘭素和棕櫚酸），5 種楓槭浸膏中這11 種香氣成分的峰面積之和占其揮發(fā)性成分總峰面積的百分比分別為43.4%、19.4%、36.0%、12.3%和30.4%；這11 種香氣成分多表現(xiàn)出焦香和甜香的特征，在賦予楓槭浸膏特征香氣方面起著重要作用。④雖然楓槭浸膏具有“能使人聯(lián)想到甲基環(huán)戊烯醇酮的香氣特征”［15］，但僅在楓槭浸膏 AP 中檢測到甲基環(huán)戊烯醇酮，而具有類似香氣特征的麥芽酚、葫蘆巴內酯、5-甲基糠醛、2-乙酰基呋喃、5-羥甲基糠醛等成分則在不同樣品中均有出現(xiàn)；同時，具有香莢蘭豆特征甜香的香蘭素均為5 種楓槭浸膏主要成分，其峰面積占比分別為25.7%、14.1%、28.6%、9.6%和24.2%。

2.4 楓槭浸膏揮發(fā)性成分的差異分析

2.4.1 One-way ANOVA 分析

采用One-way ANOVA 方法對5 種楓槭浸膏化學分析的結果進行分析，考察不同楓槭浸膏揮發(fā)性成分差異顯著性，結果見圖8。

圖7 5 個楓槭浸膏樣品的TIC 圖Fig.7 Total ion chromatograms of 5 maple concrete samples

表2 5 種楓槭浸膏的揮發(fā)性成分①Tab.2 Volatile components in 5 maple concrete samples

表2（續(xù)）

表2（續(xù)）

表2（續(xù)）

圖8 不同楓槭浸膏揮發(fā)性成分種類差異(n=5)Fig.8 Difference of types of volatile components in different maple concrete samples (n=5)

由圖8 可知，整體上5 種市售楓槭浸膏揮發(fā)性成分存在顯著差異。對于醛酮類、酸類、雜環(huán)類揮發(fā)性成分，5 種楓槭浸膏均存在顯著差異；DP 和W的碳氫化合物、DP、W 和 AP 的醇醚類、W 和 AP 的酯類（含內酯）、DP 和XH 的酚類不存在顯著差異，其余均存在顯著差異。另外，楓槭浸膏DP 以醛酮類、酯類（含內酯）、雜環(huán)類和酸類化合物為主，且醛酮類和酯類（含內酯）相對含量較高；楓槭浸膏XH 以酯類、醛酮類和酸類化合物為主，且酯類物質明顯高于其他浸膏；楓槭浸膏W 和AP 中雖然也含有較多的醛酮類物質，但總量明顯不及DP 和XH；楓槭浸膏GZ 以醛酮類、醇醚類、酯類（含內酯）和酚類物質為主，且醇醚類和酚類物質含量明顯高于其他浸膏，而這些醇醚類和酚類物質，例如芳樟醇、松油醇、香茅醇、肉桂醇、丁子香酚甲醚、茴香腦、丁子香酚、百里香酚和香芹酚等，多表現(xiàn)出一定的果香或辛香特征，這可能是楓槭浸膏GZ在感官特征上區(qū)別于其余4 種的主要原因。

2.4.2 PCA 分析

為了進一步分析5 種楓槭浸膏揮發(fā)性成分之間的差異，對楓槭浸膏樣品中每種揮發(fā)性成分峰面積與內標峰面積比（以下簡稱“面積比”）進行PCA 分析。通過交叉驗證得到主成分，每個主成分均為揮發(fā)性成分面積比的線性組合，其中前3個主成分解釋了變量樣品差異的96.3%（PC1=48.2%，PC2=27.6%，PC3=20.5%），可以代表樣品的變量特征。因此，以前3 個主成分上的得分為變量對樣品作圖（圖9）。

圖9 不同楓槭浸膏中香氣成分的PCA 二維得分圖(A1、B1)和載荷圖(A2、B2)Fig.9 Score plot（A1，B1）and loading plot（A2，B2）of aroma components in 5 maple concrete samples

由圖9 可知，PCA 二維得分圖顯示，通過PC1和PC2 可以區(qū)分楓槭浸膏GZ、AP 和XH，但不能區(qū)分楓槭浸膏DP 和W；通過PC1 和PC3 可以區(qū)分楓槭浸膏GZ、AP 和W，但不能區(qū)分楓槭浸膏DP和XH。這表明楓槭浸膏W、XH 分別與DP 的揮發(fā)性成分存在差異，但同時具有一定的相似性。

PCA 載荷圖顯示，甲基環(huán)戊烯醇酮（序號40）、對甲氧基苯乙酮（58）、苯甲酸芐酯（100）等導致楓槭浸膏AP 不同于其他4 種楓槭浸膏。3-蒈烯（2）、檸檬烯（4）、異松油烯（9）、2，4-二甲基苯乙烯（12）、對甲基苯甲醚（13）、薄荷酮（14）、薄荷醇（25）、香茅醇（35）、茴香醛（49）、柏木醇（55）、肉桂酸乙酯（57）、洋茉莉醛（68）、6-甲基香豆素（95）等導致楓槭浸膏GZ 有別于其他4 種楓槭浸膏，這些香氣成分主要具有果香、辛香香韻，從而解釋了楓槭浸膏GZ 在感官特征上不同于其他楓槭浸膏且表現(xiàn)出一定果香和辛香（圖1）的現(xiàn)象。

3 結論

建立了市售楓槭浸膏揮發(fā)性成分分析的HS-SPME/GC-MS 方法，該方法采用質譜標準譜庫結合雙保留指數法進行定性，提高了揮發(fā)性成分定性結果的準確性。5 種市售楓槭浸膏共鑒定出104 種揮發(fā)性成分，其中95 種揮發(fā)性成分具有香氣特征，其中香蘭素、5-甲基糠醛、麥芽酚和2-乙?；秽?1 種為其共有香氣成分，這些成分多呈現(xiàn)焦香和甜香香韻，是楓槭浸膏香氣特征的物質基礎。通過One-way ANOVA 和PCA 分析發(fā)現(xiàn)：5 種市售楓槭浸膏揮發(fā)性成分存在顯著差異；楓槭浸膏W、XH 分別與DP 的揮發(fā)性成分具有一定相似性；由于楓槭浸膏GZ 含有檸檬烯、茴香醛、肉桂酸乙酯等香氣成分，導致其在感官特征上不同于其他楓槭浸膏且表現(xiàn)出一定果香和辛香香韻。