腹水綜合征肉雞空腸中LPS和短鏈脂肪酸的含量檢測(cè)

趙冬冬，楊 瀾，郭宇榮，王 卓，溫 爽，申偉祺，程 佳，孫耀貴，王文魁，李宏全，段智變

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

腹水綜合征（Ascites syndrome，AS）是嚴(yán)重威脅肉雞行業(yè)的三大疾病之一，是一種營(yíng)養(yǎng)代謝病。其主要的發(fā)病因素有遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境和藥物等。AS主要發(fā)生在4～7 周齡快速生長(zhǎng)的肉雞[1]，其臨床癥狀以腹水為主要特征[2]。有學(xué)者認(rèn)為，AS 發(fā)病機(jī)理是腸道產(chǎn)氨假說(shuō)，即AS 發(fā)生時(shí)腸道菌群紊亂，引起氨氣產(chǎn)生增加，發(fā)生AS[3-4]。

哺乳動(dòng)物發(fā)生腹水時(shí)，腸道菌群發(fā)生紊亂，腸道中有害菌數(shù)量增加，有益菌數(shù)量減少，導(dǎo)致腸道中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）含量增加，引起腸道炎癥，破壞腸道黏膜屏障，有害菌及LPS 進(jìn)入血液，血液中LPS 增加會(huì)損傷肝、肺等器官，造成肺動(dòng)脈高壓和肝門靜脈高壓[5]。有研究表明，肺動(dòng)脈高壓和肝門靜脈高壓是肉雞發(fā)生腹水癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6-7]。菌群紊亂還會(huì)引起腸道中產(chǎn)短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFA）菌豐度降低，從而引起腸道中SCFA 濃度降低，SCFA 有抗炎、營(yíng)養(yǎng)腸道上皮細(xì)胞等作用[6]，當(dāng)其水平下降，腸道黏膜屏障進(jìn)一步受損，導(dǎo)致有害菌及LPS 易位，進(jìn)一步加速腹水的產(chǎn)生。因此，腸道菌群紊亂引起的LPS 和SCFA 含量改變可能在AS 發(fā)生時(shí)發(fā)揮重要作用，目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在肉雞上的相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)AS 肉雞腸道內(nèi)容物L(fēng)PS 和SCFA 含量及血清LPS 含量，探討LPS 和SCFA 在AS 發(fā)病時(shí)的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

供試肉雞為1日齡102 羽羅斯肉雞，購(gòu)自山西省文水縣大象禽業(yè)有限公司，雌雄不限。

1.2 試驗(yàn)方法

將1日齡肉雞常規(guī)育雛至7日齡，隨機(jī)分為2 組：空白組常規(guī)飼喂基礎(chǔ)日糧，模型組飼養(yǎng)環(huán)境溫度9～11 ℃，飼料中添加3%豬油和4%魚(yú)粉，飲水中添加0.12%NaCl。于 35日齡 8：00，每組取 5 羽肉雞稱質(zhì)量后進(jìn)行空腹心臟采血，將血液靜置自然凝固15 min左右，再離心20 min 左右，離心速度為3 000 r/min，取得上清液即為血清，于-80 ℃保存，用于測(cè)定LPS 水平。稱質(zhì)量后將肉雞處死，采集空腸內(nèi)容物，裝入滅菌的凍存管中，迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐，待采集完畢轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，用于測(cè)定SCFA 和LPS 含量。

1.3 空腸內(nèi)容物L(fēng)PS及血清LPS檢測(cè)

1.3.1 樣品處理 血清：用之前收集好的血清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

空腸內(nèi)容物：收集樣品后，用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩z測(cè)時(shí)，將樣品融化，加入一定量PBS，將標(biāo)本勻漿充分，3 000 r/min 離心20 min，收集上清液。

1.3.2 LPS 水平檢測(cè) 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50，100 μL 酶標(biāo)試劑，樣本孔設(shè)空白孔和待測(cè)樣品孔。待測(cè)樣品孔依次加40 μL 稀釋液、10 μL 樣品液、100 μL 酶標(biāo)試劑。封膜板封板，放置37 ℃溫育60 min。棄去液體，每孔加滿洗滌液，30 s 后棄去，重復(fù) 5 次。加入顯色劑 A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，混勻37 ℃避光顯色15 min。最后，加終止液50 μL。以空白孔調(diào)零，測(cè)孔吸光度。

1.4 空腸內(nèi)容物SCFA濃度的檢測(cè)

1.4.1 樣品處理 取肉雞空腸內(nèi)容物0.5 g 于2 mL離心管中，編號(hào)，然后在每個(gè)管中按照體積比1∶2.5 的比例加入1.25 mL 超純水，漩渦振蕩4～6 min，充分溶解；將離心管置于離心機(jī)中以10 000 r/min離心10 min；取1 mL 上清液放入2 mL 離心管中，編號(hào)，在每個(gè)離心管中按照體積比5∶1 的比例加入25%的偏磷酸溶液，放在冰水中，等待30 min。再放在離心機(jī)中離心10 min，取上清液1 mL 裝入進(jìn)樣瓶，用氣相色譜法檢測(cè)乙酸、丙酸和丁酸濃度。

1.4.2 色譜條件 色譜柱為DB-FFAP 毛細(xì)管柱；柱溫升溫程序：初始溫度為65 ℃，20 ℃/min 升溫至190 ℃；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣：氮?dú)?；載氣流速：氫氣 H235 mL/min，空氣 350 mL/min，尾吹：40 mL/min；進(jìn)樣方式：分流速率 20 mL/min，進(jìn)樣量為 1 μL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為乙酸91.91 mmol/L、丙酸66.69 mmol/L 和丁酸53.75 mmol/L混合。

制備5 個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（將混標(biāo)依次2 倍稀釋），取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 置于2 mL 離心管中，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液，充分混勻離心10 min，取1 mL 上清液置于進(jìn)樣瓶，用氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，峰面積為Y 軸，濃度為X 軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用One-way Anova 來(lái)檢測(cè)組間差異性，并以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義作為判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組肉雞空腸內(nèi)容物L(fēng)PS和血清LPS分析

由表1可知，與空白組相比，35日齡模型組肉雞空腸內(nèi)容物、血清的LPS 含量極顯著升高（P＜0.01）。

表1 各組肉雞血清和組織LPS 含量 EU/mL

2.2 肉雞空腸內(nèi)容物SCFA含量分析

2.2.1 乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 乙酸、丙酸和丁酸的濃度是橫坐標(biāo)，氣相色譜測(cè)得的峰面積是縱坐標(biāo)，用Excel 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由圖1可知，乙酸、丙酸、丁酸回歸方程分別為y＝0.449 8x＋0.411 9；y＝1.103 5x-0.994 7；y＝1.512 9x-1.084 7；R2值分別為 0.999 3，0.999 3，0.999 1。

2.2.2 肉雞空腸內(nèi)容物SCFA 含量 由表2可知，與空白組相比，模型組乙酸、丙酸、丁酸的濃度均極顯著下降（P＜0.01）。

表2 各組肉雞短鏈脂肪酸的濃度 μmol/g

3 討論

肉雞腹水綜合征嚴(yán)重危害肉雞行業(yè)，主要的臨床癥狀是肝臟腫大充血、肺部淤血、腸道及腸系膜靜脈充血水腫等。本試驗(yàn)采用低溫、高脂、高蛋白飼料及高Na+含量飲水造模，肉雞表現(xiàn)出嚴(yán)重腹水癥狀。

研究表明，肺動(dòng)脈高壓和肝門靜脈高壓是AS發(fā)生過(guò)程中重要環(huán)節(jié)[6-7]。哺乳動(dòng)物發(fā)生腹水癥時(shí)，腸道菌群失調(diào)[8]，引起腸道中LPS 水平增多，引起腸道炎癥，破壞腸道黏膜屏障，病原菌及其產(chǎn)物L(fēng)PS 移位至腸外進(jìn)入血液循環(huán)[9-10]。LPS 隨血液到各臟器，引起炎癥。研究表明，家兔靜脈注射LPS 引起肺動(dòng)脈高壓，導(dǎo)致右心衰竭，進(jìn)一步引起門靜脈高壓[11]；LPS 進(jìn)入肝臟，直接造成門靜脈高壓[12]，從而加速腹水產(chǎn)生。本試驗(yàn)表明，模型組空腸內(nèi)容物和血清中LPS 水平較空白組顯著升高，可能損傷肝肺等器官，加速肺動(dòng)脈高壓和肝門靜脈高壓的形成，參與了AS 發(fā)展。

SCFA 是由腸道中厭氧菌對(duì)碳水化合物和難以消化的粗纖維發(fā)酵產(chǎn)生，包括乙酸、丙酸和丁酸等。腹水癥動(dòng)物腸道菌群紊亂會(huì)引起腸道中產(chǎn)SCFA菌群減少[13]。有研究表明，丁酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量，為腸道上皮細(xì)胞提供60%的能量[14]；丙酸、丁酸增加ZO-1，Occludin 蛋白表達(dá)或通過(guò)增加AMPK 活性，加速緊密連接的組裝[15]，從而保護(hù)腸黏膜屏障；丁酸可增加十二指腸、空腸淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量；SCFA 降低腸道pH，對(duì)H+耐受的乳酸桿菌等有益菌存活，而對(duì)H+不耐受的大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌會(huì)被殺死[16]；丁酸促進(jìn)腸道杯狀細(xì)胞黏蛋白-2（MUC-2）的分泌，增強(qiáng)黏膜層對(duì)腸道潤(rùn)滑作用及減少致病菌黏附作用[17]，丁酸和丙酸增加抗菌肽表達(dá)[18]；SCFA 通過(guò)抑制組蛋白去乙?；福℉DAC）活性來(lái)減輕腸道的炎癥反應(yīng)，主要是核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB 活動(dòng)減弱，促炎因子產(chǎn)生減少[19]。本研究表明，與空白組相比，模型組中乙酸、丙酸和丁酸濃度顯著下降，引起腸道屏障破壞，腸道中有害菌及LPS 等有害產(chǎn)物進(jìn)入機(jī)體，加劇肉雞腹水產(chǎn)生。

4 結(jié)論

本研究表明，35日齡AS 肉雞空腸內(nèi)容物和血清LPS 含量增加，空腸內(nèi)容物SCFA 濃度下降，破壞腸道屏障，LPS 和有害菌進(jìn)入血液，進(jìn)一步加劇肝肺器官損傷，參與肉雞腹水癥發(fā)生。