抗除草劑轉(zhuǎn)基因普通白菜的獲得和檢測(cè)

胡 毅，付 超，2，王雪婷，侯雷平，李梅蘭

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.太原市小店區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西 太原 030032）

普通白菜（Brassica rapa ssp.chinensis Makino）原產(chǎn)于我國(guó)，是十字花科蕓薹屬中的一種重要蔬菜，營(yíng)養(yǎng)豐富，在全國(guó)各地均有栽培。目前，通過組織培養(yǎng)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的體系已經(jīng)日漸成熟，但是由于白菜攜帶不易再生的AA 基因型[1-2]，其轉(zhuǎn)化難度比較大，而且采用組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化除了需要較長(zhǎng)的試驗(yàn)周期外[3]，通過組織培養(yǎng)得到的植株非常容易產(chǎn)生體細(xì)胞突變，并且其后代的育性大大下降[4]。而隨著植物穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)日趨完善，近幾年興起的蘸花轉(zhuǎn)化具有操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，可以減少獲得純合后代的時(shí)間，并且大大縮短轉(zhuǎn)基因周期[5]。CLOUGH 等[6]率先利用蘸花法成功轉(zhuǎn)化了擬南芥，其轉(zhuǎn)化率為0.5%～3%。許紅梅等[7]研究結(jié)果表明，在花蕾期，采用5%的蔗糖、0.05%的Silwet L-77 表面活性劑可用于多種擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。CURTIS 等[8]在對(duì)蘿卜的蘸花轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，添加適量濃度的表面活性劑Silwet L-77 可以提高轉(zhuǎn)化效率。付紹紅等[9]使用蘸花法成功的對(duì)油菜進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到0.69%。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，影響轉(zhuǎn)化效率的因素還包括蔗糖濃度以及菌株的種類等，當(dāng)蔗糖濃度為10%且選用GV3101 菌株時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高。目前，該方法逐漸趨于成熟，已經(jīng)在擬南芥、大豆[10]、亞麻[11]、黃瓜[12]、油菜[13]、菜心[14]、大白菜[15]、甘藍(lán)[16]、紫花苜蓿[17]等作物中轉(zhuǎn)化成功。但是對(duì)于普通白菜蘸花轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道仍然鮮見。

本試驗(yàn)通過對(duì)普通白菜蘸花轉(zhuǎn)化中蘸花時(shí)長(zhǎng)、次數(shù)、蘸花間隔時(shí)間、蘸花后是否噴水等影響普通白菜蘸花轉(zhuǎn)化效率的多種因素的探究，得出一套普通白菜蘸花轉(zhuǎn)化的最優(yōu)體系，為普通白菜采用蘸花法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化建立一定基礎(chǔ)，使得大量獲得普通白菜轉(zhuǎn)基因植株更加便捷。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 供試普通白菜品種為冬性弱的75#品系，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所惠贈(zèng)。選取顆粒飽滿、大小均勻的普通白菜種子浸種催芽，2 d 后將其置于4 ℃冰箱低溫春化處理20 d。然后移栽至裝有基質(zhì)（珍珠巖、松針土、熟土及泥炭的混合物）的營(yíng)養(yǎng)缽中，待其現(xiàn)蕾抽薹后選取有少數(shù)花朵開放的蕾期植株作為供試材料。

1.1.2 農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒 供試根癌農(nóng)桿菌菌株為GV3101，該菌株含有攜帶有選擇標(biāo)記Bar 基因和GUS 報(bào)告基因的載體。其中，整合了Bar 基因的植物將抗除草劑Basta。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液制備 用接種環(huán)蘸取菌液在加入慶大霉素（Gen，100 mg/L）和卡那霉素（Kan，50 mg/L）的LB 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，2 d 后挑出單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至 10 mL 液體 LB 培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 后，取75 μL 渾濁的菌液加入150 mL液體 LB 中，28 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng) 24 h。調(diào)整菌液濃度至OD600＝0.8，離心15 min 收集菌體，重懸于 250 mL 含有 1/2 MS＋0.07%MES＋5%蔗糖＋0.05%Silwet L-77[18]的侵染液中備用。

1.2.2 蘸花 對(duì)處于花蕾期的普通白菜進(jìn)行蘸花侵染，同時(shí)為確立高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對(duì)普通白菜蘸花過程的影響因素：蘸花次數(shù)（相隔3 d 蘸2 次、相隔7 d 蘸2 次以及每相隔3 d 蘸3 次）、蘸花時(shí)間（1，2.5 min）和是否噴水（蘸花后隔日噴水和不噴水），共設(shè)計(jì)10 個(gè)處理，并將用蒸餾水蘸花處理的植株作為對(duì)照。蘸花處理之后，對(duì)其進(jìn)行人工輔助授粉，并進(jìn)行套袋隔離，待種子完全成熟之后進(jìn)行采種。

1.2.3 Basta 抗性株篩選 將待篩選T1種子播于苗盤中，待子葉長(zhǎng)出后，每3 d 噴施1 次0.002%的Basta 溶液，并及時(shí)去除黃化萎蔫的幼苗，噴施7～10 次后，篩選出仍能健康生長(zhǎng)的植株，得到具有除草劑Basta 抗性的植株。

1.2.4 GUS 活性檢測(cè) 取普通白菜的真葉作為對(duì)照，對(duì)經(jīng)過抗病篩選的植株葉片參照YONG 等[19]的方法進(jìn)行GUS 染色檢測(cè)。

1.2.5 PCR 檢測(cè) 利用CATB 法提取篩選植株的DNA，采用體外擴(kuò)增的方式對(duì)目的基因Bar 基因進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共設(shè)置39 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘸花結(jié)籽情況分析

對(duì)經(jīng)過蘸花處理后的普通白菜進(jìn)行結(jié)籽情況統(tǒng)計(jì)，結(jié)果列于表1。在蘸花時(shí)長(zhǎng)方面，同等蘸花次數(shù)與蘸花間隔時(shí)長(zhǎng)下，蘸花時(shí)間為1 min 時(shí)，所收獲的種子的數(shù)量與干質(zhì)量都要優(yōu)于蘸花時(shí)間為2.5 min時(shí)收獲的種子；在蘸花次數(shù)方面，同等條件下，共蘸2 次所收獲的種子干質(zhì)量和數(shù)量都要優(yōu)于共蘸3 次，此外進(jìn)行3 次蘸花的植株甚至出現(xiàn)了部分花序萎蔫、壞死等情況，嚴(yán)重影響結(jié)籽量；在蘸花間隔時(shí)間方面，同等條件下，蘸花間隔時(shí)間為7 d 時(shí)，收獲的種子的干質(zhì)量和數(shù)量都要優(yōu)于蘸花間隔為3 d 時(shí)；在是否噴水方面，在蘸花次日不對(duì)花序進(jìn)行噴水處理的植株出現(xiàn)了花序脫水、萎蔫、干癟等癥狀，噴水則可以有效的稀釋侵染液的濃度，并緩解相應(yīng)的脫水癥狀，導(dǎo)致結(jié)籽數(shù)和干質(zhì)量都要優(yōu)于未經(jīng)噴水處理的植株。因此，采用蘸花時(shí)間1 min，每隔3 d 蘸花1 次共蘸花2 次的組合與蘸花時(shí)間2.5 min，每隔7 d 蘸花1 次共蘸花2 次的組合，植株的結(jié)種情況較優(yōu)。整體而言，較長(zhǎng)的蘸花間隔時(shí)間（7 d）或者較短的蘸花持續(xù)時(shí)長(zhǎng)（1 min）以及蘸花后第2 天對(duì)植株噴水處理會(huì)使結(jié)籽的數(shù)量和質(zhì)量更優(yōu)。

表1 各處理普通白菜蘸花結(jié)籽情況

2.2 T1抗性植株的篩選

成功轉(zhuǎn)化的植株將具有Basta 抗性，因此，用含有0.002%的Basta 溶液對(duì)T1幼苗進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在T1幼苗中，只有第1 次試驗(yàn)中采用蘸花2.5 min，7 d 后再次蘸花，且蘸花次日不噴水的組合獲得1 株具有Basta 抗性的幼苗。其他組合均未獲得。

2.3 T1抗性植株GUS染色試驗(yàn)

成功轉(zhuǎn)化的植株因?yàn)閿y帶有GUS 報(bào)告基因，所以，能被 GUS 染液染色[20]，取具有Basta 抗性的T1幼苗真葉進(jìn)行GUS 染色試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，只有4 號(hào)幼苗的真葉能夠被GUS 染色，其他幼苗均表現(xiàn)和對(duì)照組一致。表明4 號(hào)幼苗被成功轉(zhuǎn)化。

2.4 T1抗性植株的PCR鑒定

分別提取對(duì)照組和抗性植株DNA，體外擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，4 號(hào)植株與陽性對(duì)照在同一位置都有明顯條帶，大小約為370 bp，與Bar 基因的372 bp 一致，而其他植株沒有相應(yīng)的條帶，這說明目的基因已經(jīng)成功整合到普通白菜植株中。

2.5 T2植株GUS染色試驗(yàn)

將確定已經(jīng)成功整合目的基因的4 號(hào)幼苗移入土壤中栽培，待其抽薹結(jié)籽后收獲T2種子。隨機(jī)選取30 粒種子經(jīng)春化處理后播種，待幼苗長(zhǎng)出5～6 片真葉時(shí)，取幼苗真葉進(jìn)行GUS 染色試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，T2的幼苗1～7 號(hào)葉片均能被GUS 染液染色，而對(duì)照組無法被染色，表明T2得到的植株是純合的，而且其除草劑抗性得到了穩(wěn)定遺傳。

2.6 T2植株幼苗的PCR鑒定

分別提取30 株T2植株DNA，體外擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，在待測(cè)的8 個(gè)樣本中，有7 個(gè)樣本與陽性對(duì)照在同一位置都有明顯條帶，大小約為370 bp，與Bar 基因的372 bp 一致，而陰性對(duì)照在370 bp 處無明顯條帶，說明Bar 基因已經(jīng)成功的整合并高效的遺傳給了下一代，但不排除由于多拷貝導(dǎo)致的T2植株P(guān)CR 擴(kuò)增后呈陽性的比例較高，還有待于Southern 雜交驗(yàn)證。

3 討論

不同的蘸花時(shí)間、次數(shù)以及間隔時(shí)長(zhǎng)對(duì)不同植物遺傳轉(zhuǎn)化的效果不同[21]。在早期農(nóng)桿菌真空滲透轉(zhuǎn)化擬南芥的方法中，CHUNG 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，蘸花時(shí)間由5 s 變?yōu)? min，其轉(zhuǎn)化效率大大提高，但蘸花時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響花序成活率。YANG 等[15]在大白菜中蘸花3 min，獲得轉(zhuǎn)基因植株。而本研究表明，較短的蘸花時(shí)間和較長(zhǎng)的間隔時(shí)長(zhǎng)雖然可以減輕侵染液對(duì)花蕾的負(fù)面作用，增加結(jié)籽量，但是無法獲得成功轉(zhuǎn)化的植株，只有當(dāng)蘸花時(shí)間為2.5 min時(shí)，雖然結(jié)籽量有一定影響，卻可以得到有效轉(zhuǎn)化的植株，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系中對(duì)轉(zhuǎn)化率尤為重要，尤其是無限生長(zhǎng)型花序的植株[23]。CLOUGH 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，每隔5 d 對(duì)擬南芥進(jìn)行一次蘸花處理，連續(xù)處理3 次，可以有效提高轉(zhuǎn)化效率，而大白菜每隔5～7 d 蘸花一次共蘸2 次，其轉(zhuǎn)化效率僅為0.1%，這可能是由于農(nóng)桿菌很難通過蘸花處理進(jìn)入白菜花器官[24]。本研究結(jié)果表明，只進(jìn)行1 次蘸花處理，結(jié)籽的數(shù)量與質(zhì)量要明顯優(yōu)于2 次或多次蘸花處理，蘸花時(shí)間較短時(shí)，結(jié)籽的效果也更優(yōu)。而蘸花2.5 min 并且蘸花2 次雖然植物結(jié)籽數(shù)受到較大影響，但只有這一種組合能獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因后代，因此，在使用蘸花法進(jìn)行普通白菜遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，推薦使用這一組合的處理。

關(guān)于蘸花次日是否進(jìn)行噴水處理影響結(jié)籽率與轉(zhuǎn)化成功率的方面，本研究認(rèn)為因?yàn)榍秩疽褐兴械?%蔗糖會(huì)經(jīng)由花序進(jìn)入被植物吸收，高濃度的蔗糖溶液會(huì)影響植物細(xì)胞滲透壓，使得植物出現(xiàn)脫水、萎蔫等癥狀，大大影響結(jié)籽率，而且噴水可以稀釋蔗糖濃度，減少高濃度蔗糖對(duì)植物滲透壓的影響，此外噴水還可以稀釋農(nóng)桿菌的濃度，減少農(nóng)桿菌對(duì)植物的毒害作用，雖然可以提高結(jié)籽率，但是會(huì)使轉(zhuǎn)化效率大大降低，因此，在使用蘸花法進(jìn)行普通白菜遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，不推薦進(jìn)行噴水處理。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)普通白菜蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行探索，最終得出了在使用蘸花法對(duì)普通白菜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，使用蘸花2 次、每次間隔7 d、每次蘸花2.5 min 且蘸花后不噴水處理的組合，能夠獲得具有廣譜除草劑抗性且能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因普通白菜。本試驗(yàn)將為普通白菜蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化提供一定指導(dǎo)。