溪黃草黃酮在聚乙二醇/磷酸鈉雙水相體系分配行為的研究

近年來(lái)，由于雙水相萃取技術(shù)在微生物、有機(jī)化合物等的分離和純化、預(yù)濃集過(guò)程中表現(xiàn)出相當(dāng)好的性能，并有望用于大規(guī)模提取和純化生物活性物質(zhì)，因此越來(lái)越受到人們的關(guān)注和重視[1～5]。我國(guó)粵西地區(qū)盛產(chǎn)的中草藥溪黃草，性味苦涼,具有清肝熱、利濕毒、明雙目、健脾活血和抗癌等功效，臨床可用于治療肝膽濕熱、脾失健運(yùn)所致的脅脹疼痛、食欲不振等癥,對(duì)眼赤目痛、腸胃消化不良亦有較好療效。溪黃草主要含有黃酮類(lèi)化合物、二萜化合物等[6,7]。

作者在此研究了溪黃草黃酮在聚乙二醇/磷酸鈉雙水相體系的分配行為，探討了聚乙二醇和磷酸鈉的用量、溫度、溪黃草黃酮濃度等對(duì)雙水相及萃取率的影響，為黃酮類(lèi)化合物的提純和富集提供了一些有意義的信息。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

溪黃草，購(gòu)于茂名市醫(yī)藥公司。

聚乙二醇4000、磷酸鈉、結(jié)晶氯化鋁、 無(wú)水乙酸鈉、 乙醇(95%)等，均為分析純。

WFZ-26A型紫外分光光度計(jì)，天津市光學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 溪黃草黃酮提取液的制備[8]

稱(chēng)取一定量干燥的溪黃草粉末,在索氏抽提器中用石油醚脫脂至無(wú)色,冷卻后蒸出石油醚,加入一定量的75%乙醇抽提至無(wú)色，即得溪黃草黃酮提取液。將提取液全部移至100 mL容量瓶，備用。

1.2.2 樣品溶液的制備

取溪黃草黃酮提取液5 mL于50 mL容量瓶中，加入5 mL 0.1 mol·L-1AlCl3溶液和7.5 mL 1 mol·L-1NaAc溶液，用75%乙醇稀釋至刻度，即得樣品溶液。

1.2.3 雙水相的配制

稱(chēng)取一定量的磷酸鈉于比色管中，加入15 mL 0.05 mol·L-1PEG4000水溶液，在一定的溫度下溶解靜置，形成雙水相。

1.2.4 分配行為的研究

用移液管移取3 mL樣品溶液加入到聚乙二醇/磷酸鈉雙水相體系中，攪拌均勻，靜置分層，待分配達(dá)平衡后，分別吸取上下相溶液,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在420 nm的吸光度[9]。根據(jù)吸光度的比值,按下式計(jì)算溪黃草黃酮在雙水相體系中的分配系數(shù)(K)和溪黃草黃酮的萃取率(Y)。

R=VU/VL

K=cU/cL

Y=cUVU/(cUVU+cLVL)

式中：R為相體積比；VU、VL分別為上下相體積；cU、cL分別為溪黃草黃酮在上下相的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)量配比(mPEG/mNa3PO4)對(duì)雙水相萃取溪黃草黃酮的影響(表1)

表1 質(zhì)量配比(mPEG/mNa3PO4)對(duì)溪黃草黃酮萃取的影響

由表1可以看出：

(1)在一定溫度下，溪黃草黃酮的分配系數(shù)K均大于1。這是因?yàn)橄S草黃酮是具有α-或β-苯基苯稠吡喃酮的強(qiáng)疏水性物質(zhì)，由于“相似相溶原理”，它較多地分配在富含PEG4000的強(qiáng)疏水性上相中[10],因此其K大于1。

(2)隨著磷酸鈉相對(duì)含量的增加(即mPEG/mNa3PO4的減小)，相體積比R逐漸下降，這和文獻(xiàn)[10]、[11]結(jié)論一致。這是因?yàn)閺?qiáng)電解質(zhì)磷酸鈉在水中離解為正負(fù)離子之后，由于有較強(qiáng)的形成水合離子的能力，從而部分奪取因“范德華引力”受聚乙二醇的醚鍵氧束縛的水分子之故。

(3)在一定溫度下，溪黃草黃酮的分配系數(shù)K基本上隨著磷酸鈉相對(duì)含量的增加而上升。這與文獻(xiàn)[12]結(jié)論一致。這是由于磷酸鈉的鹽析作用部分奪取聚乙二醇的醚鍵氧的“束縛水”之后，使得聚乙二醇分子排列更為整齊和緊密，熵值減少，疏水性更強(qiáng)，更有利于溪黃草黃酮分配之故。70℃時(shí)的某些反常情況，可能與接近雙水相分相“渾濁點(diǎn)”80℃有關(guān)[12]。

(4) 溪黃草黃酮萃取率Y隨著磷酸鈉相對(duì)含量的減少(即mPEG/mNa3PO4的增加)而上升，這是相體積比R逐漸增大和溪黃草黃酮分配系數(shù)K逐漸減小的綜合效應(yīng)，由此可見(jiàn)，R增大的效應(yīng)占優(yōu)。

2.2 溫度對(duì)雙水相萃取溪黃草黃酮的影響(表2)

表2 溫度對(duì)溪黃草黃酮萃取的影響

由表2可以看出：

(1)在相同mPEG/mNa3PO4和溪黃草黃酮濃度下，相體積比R隨著溫度的升高而下降。這主要是因?yàn)闇囟壬邥r(shí),PEG在水中的溶解度增加， PEG分子部分轉(zhuǎn)移到富含水的下相，導(dǎo)致上相體積減小、下相體積增大。

(2)溪黃草黃酮的分配系數(shù)K在mPEG/mNa3PO4≤1.50時(shí)，隨溫度的升高而下降；而在mPEG/mNa3PO4≥2.50時(shí)，卻隨溫度的升高而上升。這是因?yàn)闇囟壬邥r(shí)，體系粘度減小，擴(kuò)散系數(shù)增大，由濃度差所推動(dòng)的“擴(kuò)散作用”增強(qiáng)，溪黃草黃酮在上下相的濃度趨于相等，導(dǎo)致K降低而趨于1；另一方面，溫度升高，分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，溪黃草黃酮脫離親水性強(qiáng)的下相而進(jìn)入疏水性強(qiáng)的上相概率增加，同時(shí)PEG醚鍵氧束縛水的能力下降，疏水作用更強(qiáng)，導(dǎo)致溪黃草黃酮在上相的濃度增加，K升高。質(zhì)量配比不同時(shí)的分配系數(shù)變化規(guī)律是兩方面作用綜合的結(jié)果。

(3)在mPEG/mNa3PO4≤1.50時(shí)，萃取率Y隨溫度的升高顯著降低，這是相體積比R和分配系數(shù)K都下降的加合效應(yīng)的結(jié)果；而在mPEG/mNa3PO4≥2.50時(shí)，溫度升高萃取率Y變化很小，這是相體積比R下降和分配系數(shù)K上升的相消效應(yīng)的結(jié)果。

2.3 溪黃草黃酮濃度對(duì)溪黃草黃酮萃取的影響(表3)

表3 溪黃草黃酮濃度對(duì)溪黃草黃酮萃取的影響

由表3可以看出：

(1)在相同mPEG/mNa3PO4和溫度下，隨著溪黃草黃酮濃度的升高，相體積比R逐漸下降。這是由于溪黃草黃酮是強(qiáng)疏水性的物質(zhì)，有較強(qiáng)的吸附、加溶或排布在非離子型表面活性劑PEG周?chē)鷧^(qū)域的趨勢(shì)，以促進(jìn)Gibbs自由能降低、體系穩(wěn)定。溪黃草黃酮的加入，必然會(huì)改變或破壞上相PEG的較為有序的狀態(tài)，使上相物質(zhì)相互之間的疏水作用、加溶作用、靜電作用等發(fā)生了改變,部分PEG轉(zhuǎn)入下相,從而導(dǎo)致上相體積減小、下相體積增大[2]。

(2)在相同mPEG/mNa3PO4和溫度下，分配系數(shù)K基本是一個(gè)常量，差別最大是在mPEG/mNa3PO4=3.00、T=70℃時(shí)，其△K/K= 7.3%。這一結(jié)果符合Bronsted所提出的統(tǒng)計(jì)勢(shì)力學(xué)公式[13]。

(3)在mPEG/mNa3PO4較大、溫度較高的條件下，溪黃草黃酮萃取率較高，如在mPEG/mNa3PO4為 3.00、溫度為60℃時(shí)，平均萃取率為76.69%。

3 結(jié)論

利用分光光度法研究了溪黃草黃酮在聚乙二醇/磷酸鈉雙水相體系的分配行為。結(jié)果表明，在一定的溫度和溪黃草黃酮濃度下，隨著mPEG/mNa3PO4的增大，萃取率上升；在一定的質(zhì)量配比和濃度下，當(dāng)mPEG/mNa3PO4≤1.50時(shí)，萃取率隨溫度的升高顯著降低；當(dāng)mPEG/mNa3PO4≥2.50時(shí)，萃取率基本保持不變；在一定的質(zhì)量配比和溫度下，溪黃草黃酮濃度對(duì)分配系數(shù)K(cU/cL)和萃取率基本沒(méi)有影響。在mPEG/mNa3PO4=3.00、T=60℃時(shí)，平均萃取率可達(dá)76.69%。

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