典型農(nóng)田退耕后土壤真菌與細(xì)菌群落的演替

張露琪,張志明,張麗梅,王軍濤,*

1 云南大學(xué)生態(tài)學(xué)與環(huán)境學(xué)院云南省高原山地生態(tài)與退化環(huán)境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650091 2 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100085

我國(guó)西南地區(qū)以山地、丘陵為主,其地形破碎、山地坡度大、土層薄。在該區(qū)域進(jìn)行耕種不僅糧食產(chǎn)量低,而且頻繁引發(fā)水土流失、山體滑坡甚至泥石流等一系列生態(tài)問(wèn)題[1]。鑒于此,我國(guó)于2002年開(kāi)始在該地區(qū)全面實(shí)施退耕還林工程以恢復(fù)生態(tài)環(huán)境。云南省作為退耕還林工程的重要省份之一,其退耕強(qiáng)度在西南地區(qū)乃至全國(guó)都占據(jù)了較大比重。隨著退耕還林工程的開(kāi)展,亟需對(duì)退耕還林工程的生態(tài)效益進(jìn)行評(píng)估,以期為進(jìn)一步的生態(tài)建設(shè)工程決策提供科學(xué)依據(jù)[2-3]。在諸多評(píng)價(jià)指標(biāo)中,生物群落的恢復(fù)狀況是一個(gè)重要方面[4]。普遍認(rèn)為,農(nóng)田退耕并撂荒以后,地上部植物群落會(huì)由草本階段開(kāi)始,經(jīng)灌木群落時(shí)期演替到早期森林群落階段,并最終演替為森林群落后期[5]。而植物群落構(gòu)建與恢復(fù)的這一過(guò)程中伴隨著生態(tài)系統(tǒng)功能的恢復(fù),包括土壤碳固持增加、水土保持能力增強(qiáng)以及棲息地恢復(fù)帶來(lái)的動(dòng)物種群重建等[6-7]。

作為地下生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,土壤微生物(特別是真菌和細(xì)菌)驅(qū)動(dòng)著元素在整個(gè)陸地生態(tài)系統(tǒng)中的生物地球化學(xué)循環(huán)[8],在養(yǎng)分元素的獲取、致病性與抗逆性等方面與地上部的植物群落存在著極其密切的聯(lián)系[9-10]。鑒于其重要的生態(tài)功能,土壤微生物的群落變化也被認(rèn)為是評(píng)價(jià)生態(tài)恢復(fù)成功與否的重要指標(biāo)[11]。由于土壤微生物肉眼不可見(jiàn)的特點(diǎn)以及方法學(xué)的限制,早期的研究往往以酶活性、生物量等分辨率不高的群落整體指標(biāo)作為測(cè)度參數(shù)[12-13]。事實(shí)上,無(wú)論是功能還是對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng),真菌和細(xì)菌均存在著明顯的差異：前者通過(guò)菌絲、菌根等與植物建立更為直接的聯(lián)系,后者對(duì)于根際環(huán)境和土壤養(yǎng)分更為敏感；在較大的空間尺度上,真菌和細(xì)菌群落都會(huì)不同程度地響應(yīng)地上部植物群落的變化,比如在全球尺度的草原生態(tài)系統(tǒng)中,真菌和細(xì)菌都隨著植物的多樣性增加而增加,但真菌與植物的相關(guān)性比細(xì)菌更強(qiáng)[14]。在冰川前緣隨土壤發(fā)育過(guò)程的初級(jí)演替中,真菌和細(xì)菌也表現(xiàn)出不同的群落構(gòu)建策略,前者比后者更易受植物和非隨機(jī)過(guò)程的影響[15]。因此,真菌和細(xì)菌的生態(tài)位分化可能會(huì)影響到對(duì)生態(tài)恢復(fù)的評(píng)價(jià)結(jié)果,應(yīng)引起足夠的重視。

農(nóng)田退耕后,地上植物群落的演替過(guò)程與其在土壤發(fā)育過(guò)程中的初級(jí)演替類(lèi)似,都是由草本植物群落開(kāi)始經(jīng)灌木演替到森林的過(guò)程；但不同的是,土壤發(fā)育過(guò)程中的初級(jí)演替是以貧瘠的“巖石-裸地”作為起點(diǎn),而農(nóng)田退耕后的演替起點(diǎn)是發(fā)育完全、養(yǎng)分豐富的成熟土壤。大量研究表明,農(nóng)田管理措施如施肥、單一種植等顯著改變了土壤微生物的群落組成及多樣性[16-17]。這也意味著農(nóng)田退耕后土壤微生物群落的演替起點(diǎn)是經(jīng)歷了長(zhǎng)期人為擾動(dòng)的群落：失去了肥料的持續(xù)供給,對(duì)速效養(yǎng)分敏感的土壤細(xì)菌可能最先產(chǎn)生響應(yīng)；不再進(jìn)行單一種植后,植物的多樣性開(kāi)始增加,真菌可能與植物建立更為密切的聯(lián)系。而對(duì)于這一過(guò)程中,土壤真菌和細(xì)菌在不同植物群落演替階段的變化及其最終達(dá)到的穩(wěn)定狀態(tài),仍然缺乏足夠的了解。因此,本研究在我國(guó)西南退耕的典型區(qū)域——云南省迪慶州設(shè)置退耕還林監(jiān)測(cè)樣地,研究農(nóng)田退耕后土壤真菌和細(xì)菌對(duì)植物群落演替的響應(yīng)。通過(guò)高分辨率、免培養(yǎng)的高通量測(cè)序方法分析土壤總DNA中18S rRNA基因和16S rRNA基因,比較了農(nóng)田退耕還林后不同演替階段土壤真菌和細(xì)菌群落組成和多樣性隨著植物群落的變化規(guī)律,以期為全面而準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)退耕還林的生態(tài)效益提供數(shù)據(jù)支撐。

1 研究區(qū)域與研究方法

1.1 研究區(qū)域概況

云南省迪慶州地處低緯高原區(qū),氣候類(lèi)型為亞熱帶與溫帶季風(fēng)高原山地氣候,平均氣溫在15℃左右,全年無(wú)夏,春季秋季相連,冬季漫長(zhǎng)。自然植被以亞熱帶常綠闊葉林為主,研究區(qū)植被以生態(tài)保護(hù)林和生態(tài)經(jīng)濟(jì)林為主,其優(yōu)勢(shì)樹(shù)種包括云南松(Pinusyunnanensis)、槲櫟(Quercusaliena)及銀木荷(Schimaargentea)等。由于地勢(shì)陡峭加之河水沖刷和自然風(fēng)化,地形常被分割形成典型的“V”型地貌,高山、河谷、山間盆地交錯(cuò)。坡地開(kāi)墾為農(nóng)田后,由于水土流失嚴(yán)重造成土質(zhì)貧瘠、糧食產(chǎn)量低下,滑坡和泥石流等自然災(zāi)害頻發(fā)。為恢復(fù)生態(tài)環(huán)境,地方政府于2003年起實(shí)行逐步退耕還林的措施。

1.2 研究方法

1.2.1樣方設(shè)置與土樣采集

監(jiān)測(cè)樣地位于迪慶州維西傈僳族自治縣保和鎮(zhèn)西北部34公里的白濟(jì)汛鄉(xiāng)瀾滄江峽谷(27°21′6″N,99°5′15″E),海拔1700 m左右,土壤類(lèi)型為紅壤。2003年以前,該區(qū)域土地利用方式主要為由天然林開(kāi)墾而來(lái)的農(nóng)田；退耕還林政策實(shí)施后,逐步對(duì)原有農(nóng)田進(jìn)行退耕。由于退耕年限不同,在同一海拔段相鄰的區(qū)域(約2 km2范圍內(nèi))同時(shí)存在著處于不同植被群落恢復(fù)階段的農(nóng)田、撂荒草地(退耕2年)、撂荒灌叢(退耕8年,i)、邊緣灌叢(ii)等樣地,各樣地地勢(shì)均較為平緩,最大海拔差不超過(guò)20米；同時(shí),該區(qū)域內(nèi)還存有未經(jīng)砍伐的天然林(林地i)以及人工林(林地ii),可作為演替頂級(jí)對(duì)照(表1)。2011年11月,分別在不同植被下設(shè)置樣方,其中農(nóng)田設(shè)置3個(gè)5 m×5 m的樣方,每個(gè)樣方間距10 m；撂荒草地設(shè)置3條2 m×10 m的樣帶,每條樣帶間距5 m；撂荒灌叢設(shè)置3個(gè)10 m×20 m的樣方,每個(gè)樣方間距大于10 m；林地內(nèi)各設(shè)置3個(gè)20 m×20 m樣方。樣方內(nèi)使用“M”形5點(diǎn)采樣法,取0—10 cm的表層土壤并混為1個(gè)土樣,每種植被3個(gè)重復(fù),共得到18個(gè)土壤樣本。剔除根系及石礫等雜物后裝入封口袋并用4℃保溫箱運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室。新鮮土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后充分混勻并過(guò)2 mm的篩后放到-20℃冰箱保存,用于土壤總DNA提取。

表1 農(nóng)田退耕后不同演替階段地上部植物群落組成

1.2.2土壤總DNA提取、真菌18S rRNA基因與細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增

使用MoBio Power Soil土壤DNA提取試劑盒(MOBIO laboratories, Carlsbad, California, USA)提取土壤總DNA。除了細(xì)胞破碎步驟替換為“使用FastPrep- 24核酸提取儀在4.5強(qiáng)度下破碎30s(MP Biomedicals, CA, USA)”之外其他所有操作均按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行[18]。提取出的DNA使用NanoDrop? ND- 2000c UV-Vis分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)檢測(cè)濃度與質(zhì)量后,置于-80℃冰箱保存。

DNA提取液稀釋10倍后,使用ABI GeneAmp?9700型PCR儀 (ABI, Foster City, CA, USA)對(duì)真菌18S rRNA 基因與細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。真菌18S rRNA基因擴(kuò)增使用的引物為NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC- 3′),NS8(5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA- 3′)[19],20 μL反應(yīng)體系中包括4 μL 5× FastPfu 緩沖液、2 μL dNTP (2.5 μmol/L),前后引物各0.4 μL(5μmol/L)、0.4 μL FastPfu DNA聚合酶和10 ng 模板DNA(最后加水補(bǔ)至20 μL)。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)熱2min,95℃解鏈30s,55℃退火30s,72℃延長(zhǎng)30s(細(xì)菌25個(gè)循環(huán),真菌30個(gè)循環(huán)),最后72℃保持5 min。細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增使用的引物為563F (5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′),907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT- 3′)[20],反應(yīng)體系及條件與真菌的一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收和定量檢測(cè),加接頭建庫(kù)、等摩爾混合后在454 GS FLX Titanium測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3生物信息分析及統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)使用QIIME[21]去除barcode、引物及嵌合體(identify_chimeric_seqs.py)后,得到的fasta格式數(shù)據(jù)以97%的序列相似度聚合為OTU(Operational Taxonomic Unit,可分類(lèi)操作單元)。細(xì)菌和真菌分別獲得了280952和115403條高質(zhì)量序列。OTU 表格轉(zhuǎn)換為biom格式后導(dǎo)入QIIME進(jìn)行重取樣和多樣性分析；OTU代表序列使用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)[22]進(jìn)行注釋和比對(duì)。為消除系統(tǒng)誤差導(dǎo)致的樣本序列數(shù)不均勻?qū)Χ鄻有越y(tǒng)計(jì)的影響,使用single_rarefaction.py命令進(jìn)行重取樣,真菌和細(xì)菌的重取樣深度分別為5826和11124條序列。群落組成分析及多樣性分析均在重取樣之后97%序列相似度的OTU水平上進(jìn)行。使用Shannon指數(shù)H′表征alpha多樣性指數(shù),Bray-Curtis相異性指數(shù)BCij表征beta多樣性,公式分別如下所示：

(1)

(2)

式中S表示總的微生物OTU數(shù),pi表示第i個(gè)OTU占總數(shù)的比例；Si和Sj分別代表群落i和群落j中所有OTU的總數(shù)量,Cij表示群落i和群落j共有OTU中較小值的總和。

使用QIIME中的upgma_cluster.py腳本對(duì)所有樣本的Bray-Curtis矩陣進(jìn)行非加權(quán)組平均法聚類(lèi)(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)。聚類(lèi)樹(shù)經(jīng)由MEGA軟件導(dǎo)出。真菌和細(xì)菌多樣性的相關(guān)關(guān)系使用Pearson相關(guān)系數(shù)表征,其中Bray-Curtis矩陣之間的相關(guān)性基于Mantel分析實(shí)現(xiàn)(使用R軟件中的vegan包[23],置換檢驗(yàn)次數(shù)為999次),并在R軟件(www.r-project.org/)中使用ggplot2包完成線性擬合(包含95%置信區(qū)間)。方差分析、柱形圖及箱式圖均在R中完成。

2 研究結(jié)果

2.1 農(nóng)田退耕后不同演替階段土壤真菌和細(xì)菌群落的變化

土壤真菌群落中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群主要包括子囊菌(Ascomycota)和擔(dān)子菌(Basidiomycota)兩大類(lèi)(圖1)。子囊菌是相對(duì)多度最高的類(lèi)群,其在所有樣本中所占的平均比例為47.0%；其次為擔(dān)子菌,在所有樣本中的所占的平均比例為17.3%。農(nóng)田退耕后隨著演替的進(jìn)行,不同階段的真菌群落組成有較大差異,其中以子囊菌門(mén)下糞殼菌綱(Sordariomycetes)和擔(dān)子菌門(mén)下傘菌綱(Agaricomycetes)的變化最為明顯：前者相對(duì)多度由農(nóng)田階段的30%減至林地階段的10%左右,后者相對(duì)多度由農(nóng)田階段的5%以下增加至林地階段的20%以上。此外,子囊菌門(mén)下的座囊菌綱(Dothideomycetes)在演替前期的相對(duì)多度也明顯高于后期。

土壤細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群主要包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)等(圖1)。其中,變形菌所占比例最高,在所有樣本中的平均比例達(dá)36.0%；放線菌和酸桿菌在所有樣本中的平均相對(duì)豐度為16.1%和14.4%；其他類(lèi)群的比例均在10%以下。除了酸桿菌在農(nóng)田和林地ii(人工林)土壤中的比例明顯低于草地土壤和灌叢土壤外,其他優(yōu)勢(shì)類(lèi)群在不同演替階段并無(wú)明顯差異。

圖1 農(nóng)田退耕后土壤真菌和細(xì)菌在不同演替階段的群落組成變化Fig.1 Succession of soil fungal and bacterial communities after farmland abandonment(phylum level)真菌圖例中,A代表子囊菌門(mén)Ascomycota,B代表?yè)?dān)子菌門(mén)Basidiomycota,G代表球囊菌門(mén)Glomeromycota,D代表雙核亞界Dikarya

通過(guò)構(gòu)建基于Bray-Curtis指數(shù)的UPGMA聚類(lèi)樹(shù),進(jìn)一步在OTU水平上比較了不同演替階段真菌和細(xì)菌群落組成的差異。結(jié)果表明,真菌和細(xì)菌群落均隨植物群落的演替而變化,同一植物群落下微生物群落更為相似,但整體而言真菌群落與地上部植物群落的演替規(guī)律同步性更好(synchronism)(圖2),即當(dāng)?shù)厣现参锶郝漕?lèi)型發(fā)生更替時(shí),相應(yīng)地地下土壤真菌群落組成也發(fā)生了顯著改變。值得指出的是,林地i(天然林)土壤中的細(xì)菌或真菌群落均與其他植物群落下的存在較大的差異,表明人為擾動(dòng)對(duì)微生物群落的影響可能在比較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)持續(xù)存在。

圖2 基于UPGMA聚類(lèi)樹(shù)的土壤真菌和細(xì)菌群落在退耕農(nóng)田不同演替階段的差異比較Fig.2 UPGMA clustering of soil fungal and bacterial communities along the chronosequences of abandoned farmland

2.2 農(nóng)田退耕后不同演替階段土壤真菌和細(xì)菌多樣性的變化

以Shannon多樣性指數(shù)為測(cè)度指標(biāo),比較了農(nóng)田退耕后土壤真菌和細(xì)菌的alpha多樣性在不同演替階段的變化?？梢钥闯?真菌多樣性在不同的演替階段之間的變化不甚明顯,但整體而言在農(nóng)田土壤中偏高而林地i(天然林)土壤中偏低(圖3)。細(xì)菌多樣性的變化與真菌相似且更為明顯(圖3)：其在農(nóng)田土壤中最高,而在林地i(天然林)土壤中顯著(P<0.01)低于其他植物群落；農(nóng)田撂荒后,細(xì)菌多樣性呈現(xiàn)先急劇下降、然后隨著演替過(guò)程的推移而緩慢上升的趨勢(shì)。

圖3 農(nóng)田退耕后不同演替階段土壤真菌和細(xì)菌Shannon指數(shù)的比較Fig.3 Comparison on soil fungal and bacterial diversity at different successional stages of the abandoned farmland as measured using Shannon index

進(jìn)一步的相關(guān)分析表明,細(xì)菌和真菌在隨植物群落演替過(guò)程中多樣性的變化趨勢(shì)基本一致,即當(dāng)細(xì)菌多樣性增加的同時(shí),真菌多樣性也增加(圖4)。其中,真菌alpha多樣性和細(xì)菌alpha多樣性之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(圖4,r=0.46,P=0.05),真菌beta多樣性和細(xì)菌的beta多樣性之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(圖4,r=0.69,P<0.01)。

3 討論

群落的恢復(fù)狀況是評(píng)價(jià)退耕還林生態(tài)效益的重要指標(biāo)。通過(guò)對(duì)土壤真菌和細(xì)菌群落組成和多樣性的分析和比較,我們初步揭示了農(nóng)田退耕后地下的微生物群落隨著植物群落演替的變化特征。整體而言,農(nóng)田退耕后土壤真菌的群落組成隨植物群落演替的變化比細(xì)菌更為明顯,其優(yōu)勢(shì)類(lèi)群糞殼菌綱和傘菌綱隨著演替的進(jìn)行分別呈現(xiàn)出減少和增加的趨勢(shì)。糞殼菌綱作為子囊菌門(mén)的重要類(lèi)群,較擔(dān)子菌相比具有更高的基因替代速率[24],研究也表明在連續(xù)耕種的土壤中糞殼菌綱的相對(duì)多度會(huì)隨著連作年限增加而增加[25],因而其對(duì)長(zhǎng)期的人為擾動(dòng)環(huán)境可能具有更好的適應(yīng)能力。而傘菌綱作為擔(dān)子菌門(mén)重要的一類(lèi)真菌,更多的依賴(lài)對(duì)木質(zhì)組分的腐化來(lái)獲取碳源并拓展生存空間或者通過(guò)形成外生菌根與植物共棲[26]。農(nóng)田退耕之前的人為擾動(dòng)不利于土壤中木質(zhì)組分的累積以及植物群落的穩(wěn)定,退耕后植物殘?bào)w的累積以及木本植物多樣性的增加更有利于傘菌的生長(zhǎng)。

農(nóng)田退耕之后,土壤真菌和細(xì)菌的多樣性響應(yīng)植物群落的變化而改變,證明了空間尺度上地上植物和地下微生物的協(xié)同變化在時(shí)間尺度上同樣適用[27]。在隨著地上部植物群落的演替過(guò)程中,真菌和細(xì)菌的alpha和beta多樣性都呈現(xiàn)出較好的正相關(guān)關(guān)系,特別是beta多樣性。這一結(jié)果說(shuō)明真菌和細(xì)菌對(duì)于植物群落演替的響應(yīng)具有一定的同步性,而土壤真菌和細(xì)菌的生態(tài)位分化可能導(dǎo)致了二者的差異性。土壤細(xì)菌的多樣性呈現(xiàn)出明顯的先降低再緩慢升高的趨勢(shì),與我們的假設(shè)基本一致：農(nóng)田退耕并撂荒以后,人為干擾減弱,土壤養(yǎng)分、特別是N輸入劇減,因而對(duì)速效養(yǎng)分敏感的細(xì)菌響應(yīng)最為劇烈。真菌的多樣性大體也呈現(xiàn)這種趨勢(shì),但比之細(xì)菌卻又有所不同,比如在灌叢的不同階段其多樣性也有所差異,可歸因于土壤真菌與地上部植被的聯(lián)系更為密切。Li等在黃土高原的研究結(jié)果與本研究類(lèi)似：在農(nóng)田退耕后的演替過(guò)程中,真菌的數(shù)量隨植物群落的演替呈現(xiàn)顯著的增加趨勢(shì)[28]。

值得注意的是,無(wú)論在群落組成還是多樣性上,作為演替終點(diǎn)對(duì)照的天然林土壤中的真菌和細(xì)菌均明顯區(qū)別于其它經(jīng)歷了人為干擾的演替階段,即包括農(nóng)藥/化肥施用和單一種植在內(nèi)的耕作擾動(dòng)可能對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生了長(zhǎng)期影響。在“歷史-生態(tài)”的理論框架下[29],這意味著現(xiàn)在的耕種活動(dòng)作為未來(lái)的“歷史”,其“遺存”可在較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)存在,而關(guān)于“黃土高原退耕農(nóng)田土壤細(xì)菌的多樣性在退耕15—20年后方得到部分恢復(fù)”的研究結(jié)果一定程度上支持這一假設(shè)[30]。通過(guò)基于“多樣性-穩(wěn)定性”理論的微生物群落構(gòu)建模型則可將這一過(guò)程進(jìn)一步細(xì)化[31]：微生物群落在擾動(dòng)壓力下較快地達(dá)到一個(gè)(中間)適應(yīng)狀態(tài)(事實(shí)上大量研究都表明微生物對(duì)外界變化的響應(yīng)是非常迅速的)；當(dāng)擾動(dòng)壓力消除之后,群落有可能逐漸恢復(fù)為原來(lái)的初始狀態(tài),而這將會(huì)是一個(gè)漫長(zhǎng)的時(shí)期,甚至可能滯后于地上植物的群落恢復(fù)過(guò)程。這一發(fā)現(xiàn)可能揭示了地下生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)歷擾動(dòng)之后恢復(fù)的脆弱性,也強(qiáng)調(diào)了在未來(lái)的生態(tài)保育工作中地下生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)引起我們的重視。

4 結(jié)論

通過(guò)比較農(nóng)田退耕后不同植被恢復(fù)階段的土壤真菌和細(xì)菌群落組成和多樣性的變化,揭示了土壤真菌和細(xì)菌響應(yīng)植物群落演替的特征,特別是真菌群落隨著植被的變化比細(xì)菌群落更為敏感的特點(diǎn)。本研究補(bǔ)充了農(nóng)田退耕還林后地下生物群落演替的相關(guān)內(nèi)容,有望為準(zhǔn)確而完整的評(píng)價(jià)退耕還林的生態(tài)效益提供數(shù)據(jù)支撐。