高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中維生素A和維生素E的含量

徐 銳，陳 中

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.美贊臣營養(yǎng)品(中國)有限公司，廣東 廣州 510730)

維生素A(vitamin A)又名視黃醇，屬于脂溶性生素，維生素A對于嬰幼兒的骨骼和視力的生長發(fā)育有很大的作用。維生素A不但可以維持正常的視覺功能防止夜盲癥，而且還具有維持上皮細胞結(jié)構(gòu)的完整與健康、促進機體正常生長發(fā)育、增強機體的造血功能和預(yù)防癌癥等十分重要的功能[1-2]。維生素E(vitamin E)又名抗不育維生素或生育酚，具有抗不育功能和抗氧化作用[3]。生育酚是人體不可缺少的營養(yǎng)素，其四種異構(gòu)體的構(gòu)型與磷脂中多不飽和脂肪酸的構(gòu)型互補而具有較強的清除氧自由基能力，保護組織完整性，在生命過程中起重要作用。維生素E包括生育酚和三烯生育酚兩類共8種化合物，即α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚，其中α-生育酚分布最廣、生物活性最高，δ-生育酚抗氧化能力最強。生育酚對人體有重要的生理功能，具有抗氧化、抗衰老、抗不育、調(diào)節(jié)免疫力等作用，對生殖功能﹑細胞代謝均有影響[3]。維生素A和維生素E是嬰幼兒奶粉中一重要營養(yǎng)添加劑，其含量必須經(jīng)過檢測，因此建立維生素A和維生素E的檢測方法對監(jiān)測其含量意義重大。

目前測定奶粉中維生素A和維生素E的方法有紫外分光光度法、薄層層析法、熒光法、氣相色譜法和高效液相色譜法[4-9]等，高效液相色譜法(以下簡稱HPLC法)具有快速、準確、樣品前處理簡單以及分辨率高等優(yōu)點，HPLC法分為反相HPLC法和正相HPLC法，國家標準方法GB/T 5009.82-2003[6]、GB 5413.9-2010[7]和GB5009.82-2016[8]屬于皂化-反相色譜法，但是反相HPLC法在測定維生素A和維生素E時出峰時間長，分離維生素E的四種異構(gòu)體時峰型和分離度欠佳，對柱子和柱溫要求過高，一般柱子無法分離β-生育酚和γ-生育酚，C30柱又需要控制在柱溫20℃，對于一些小的實驗室很難滿足這個要求。國際標準方法AOAC Offcial Method 2012.10[9](AOAC法)屬于直接提取-正相色譜法，AOAC法可以實現(xiàn)維生素A和維生素E四種異構(gòu)體的完美分離，維生素A和維生素E時出峰時間長，且同時用到紫外檢測器和熒光檢測器，所以尋求一種的方法去測定維生素A和維生素E四種異構(gòu)體的含量意義重大，皂化-正相HPLC法綜合皂化-反相色譜法和直接提取-正相色譜法的優(yōu)點可以快速正確測定維生素A和維生素E四種異構(gòu)體的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

視黃醇標準品和α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標準品(含量≥95%)，美國Sigma公司；正己烷、四氫呋喃均為色譜純，J.T.Baker；氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純，廣州化學(xué)試劑；BHT，美國Sigma公司。

Cary 60紫外可見分光光度計：美國Agilent公司；HZS-HA水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；AB304-S型電子天平：瑞士梅特勒一托利多公司；2690型高效液相色譜儀配2487型紫外檢測器：美國Waters公司。

1.2 試劑及標準品制備

1.2.1 試劑制備

氫氧化鈉溶液(10 mol/L)：稱取400 g氫氧化鈉用milli-Q水溶解并定容至1 L，有效期三周。

0.1%BHT乙醇溶液(m/v)：稱取1 gBHT用乙醇溶解并定容至1 L，有效期一個月。

1.2.2 標準品制備

維生素 A 標準儲備液(視黃醇)(0.5 mg/mL)：精確稱取25 mg的維生素 A 標準品，用正己烷溶解并定容于 50 mL 棕色容量瓶中，在-20℃下避光保存，效期1個月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進行濃度校正。

維生素 E 標準儲備液(α-生育酚)(1.0 mg/mL)：精確稱取50 mg的維生素E標準品，用正己烷溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。在-20℃下避光保存，有效期6個月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進行濃度校正。

維生素 E 標準儲備液(β-生育酚)(1.0 mg/mL)：精確稱取50 mg的維生素E標準品，用正己烷溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。在-20℃下避光保存，有效期6個月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進行濃度校正。

維生素 E 標準儲備液(γ-生育酚)(1.0 mg/mL)：精確稱取50 mg的維生素 E標準品，用正己烷溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。在-20℃下避光保存，有效期6個月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進行濃度校正。

維生素 E 標準儲備液(δ-生育酚)(1.0 mg/mL)：精確稱取50 mg的維生素E標準品，用正己烷溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。在-20 ℃下避光保存，有效期6個月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進行濃度校正。

維生素A 和維生素E混合標準溶液中間液：準確吸取維生素A 標準儲備溶液1.00 mL和維生素E 標準儲備溶液各5.00 mL于同一50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，此溶液中維生素A 濃度為10.0 μg/mL，維生素E各生育酚濃度為100 μg/mL。在-20℃下避光保存，有效期半個月。維生素A和維生素E標準系列工作溶液：分別準確吸取維生素A和維生素E混合標準溶液中間液0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，該標準系列中維生素A濃度為0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 μg/mL，維生素E濃度為2.00、5.00、10.0、20.0、40.0、60.0 μg/mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

精確稱取2～5 g奶粉樣品于150 mL三角瓶中，加入20 mL溫水溶解，再30 mL 0.1% BHT乙醇溶液和9 mL10 mol/L氫氧化鈉溶液，于60℃水浴鍋皂化40 min，轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗，分別用50 mL正己烷萃取2次，再用mill-Q水水洗至中性，經(jīng)無水硫酸鈉脫水處理，在50℃旋蒸至2 mL左右氮吹至干，用正己烷溶解轉(zhuǎn)移并定容至10 mL棕色容量瓶中，過0.45 μm有機濾膜，上機待測。

1.3.2 色譜條件

流動相A為純四氫呋喃，流動相B為純正己烷， 采用等度洗脫，正己烷：四氫呋喃=90:10，α-生育酚的保留時間是2.9 min，β-生育酚的保留時間是3.2 min，γ-生育酚的保留時間是3.6 min，δ-生育酚的保留時間是4.0 min，維生素A的保留時間是7.9 min。流速為 1.5 mL/min，紫外檢測波長分別為294 nm和325 nm，柱溫40℃，進樣量25 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

本試驗的目的是研究高效液相色譜法正相法同時測定奶粉中的維生素A和4種維生素E異構(gòu)體的含量方法。樣品經(jīng)過皂化、正己烷萃取分離純化后，用硅膠柱zorbax Rx-SIL直接分離維生素A和4種維生素E異構(gòu)體。在諸多色譜條件中，流動相的選擇是分析方法研發(fā)的重點。流動相中四氫呋喃的比例對異構(gòu)體保留時間有較大影響，當流動相正己烷：四氫呋喃比例為96∶4時，維生素A和4種維生素E異構(gòu)體分離效果最佳，但是保留時間比較長，優(yōu)化色譜條件后正己烷：四氫呋喃比例為90∶10，柱溫40℃，流速為1.5 mL/min，維生素A和4種維生素E異構(gòu)體完全分離，5種物質(zhì)8 min內(nèi)出峰(見圖1示)。

1.α-生育酚;2.β-生育酚;3.γ-生育酚;4.δ-生育酚;5.VA

圖1 4種生育酚和維生素A正相高效液相色譜圖

Fig.1 High performance liquid chromatography of 4 tocopherols and vitamin A

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 線性關(guān)系、檢測限和定量限

按照1.2.2配置一系列不同質(zhì)量濃度生育酚和維生素A混合標準工作溶液，進樣分析，以目標物的峰面積y為縱坐標，質(zhì)量濃度x為橫坐標制作標準曲線，結(jié)果見表1。由表1可以看出，生育酚在2～60μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，維生素A在0.2～60 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，滿足檢測需求。檢出限和定量限以向空白樣品中逐級降低加標濃度的方法來確定，以色譜峰信噪比(S/N)*3為方法的檢出限，信噪比(S/N)*10為定量限。生育酚的檢出限為0.07～0.14 mg/kg，生育酚的定量限為0.12～0.4 mg/kg，維生素A的檢出限為0.02 mg/kg，維生素A的定量限為0.04 mg/kg。

表1 4種生育酚和維生素A的線性關(guān)系、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.2.2 方法重現(xiàn)性、回收率和精密度

取標準溶液(0.2 μg/mL)連續(xù)進樣5次，計算峰面積之間的RSD%，用來確定儀器精密度。結(jié)果顯示，維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和維生素A的RSD分別為0.81%、0．25%、 0.39%、1.64%、1.44%，均小于3%，重現(xiàn)性良好。用奶粉進行加標回收試驗，加不同濃度3個級別的標準，平行2份，因為奶粉中維生素A和維生素E主要是以視黃醇和α-生育酚為主，β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量很低，所以加標只加維生素A和α-生育酚，計算方法回收率及精密度。結(jié)果顯示，在線性范圍內(nèi)，維生素A的回收率范圍為84.05%～89.17%，α-生育酚的回收率范圍為85.36%～91.29%，在80%～100%范圍內(nèi)；RSD分別為3.27%、3.77%，均在5%范圍以內(nèi)。以上顯示，該方法具有良好的重現(xiàn)性和精密度，能夠開展奶粉中的維生素A和四種維生素E異構(gòu)體的含量測定研究。

2.3 樣品實測結(jié)果

選取2種奶粉樣品用高效液相色譜法分別測定2種奶粉的維生素A和4種維生素E異構(gòu)體含量，平行2份，最終計算出維生素A和維生素E含量，按上述樣品處理和色譜方法，測定維生素A和維生素E含量，結(jié)果見表2，樣品色譜圖見圖2，結(jié)果顯示奶粉中4種維生素E異構(gòu)體的含量以α-生育酚的含量最高，其他3種生育酚含量較低，參考GB5009.82-2016計算方式：維生素E(mg α-TE/100 g)=α-生育酚(mg/100 g)+β-生育酚(mg/100 g)×0.5+γ-生育酚(mg/100 g)×0.1+δ-生育酚(mg/100 g)×0.01。最終維生素A和維生素E的結(jié)果均在奶粉樣品的標準范圍內(nèi)。

表2 維生素A和維生素E的含量

圖2 樣品色譜圖

Fig.2 Sample chromatogram

奶粉樣品1維生素A的標準含量范圍是430～990 μg/100 g，奶粉樣品1維生素E的標準含量范圍是4.98～11.09 mg/100 g，奶粉樣品2維生素A的標準含量范圍是477～897 μg/100g，奶粉樣品2維生素E的標準含量范圍是3.22～10.00 mg/100g，從表2結(jié)果來看，2個奶粉樣品的維生素A和維生素E的結(jié)果均在奶粉樣品的標準含量范圍內(nèi)。

2.4 樣品比對結(jié)果

選取1種奶粉樣品用本文建立的方法和國標方法(GB5009.82-2016第一法)同時測定該奶粉中的維生素A和4種維生素E異構(gòu)體含量，平行2份，最終計算出維生素A和維生素E含量，結(jié)果見表3。

表3 維生素A和維生素E的含量

從表3結(jié)果來看：GB5009.82-2016第一法和本法檢測結(jié)果差值<5%，無顯著差異，本法可以用來檢測奶粉中維生素A和維生素E含量。

3 結(jié)論

選用Agilent Zorbax RX-SIL柱正相分離維生素A和α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚，以正己烷-四氫呋喃(90∶10)為流動相，等度洗脫，流速1.5 mL/min，在294 nm波長下檢測維生素E，在325 nm波長下檢測維生素A，分離效果較佳，實際檢測奶粉樣品，其結(jié)果在標準范圍內(nèi)，與國標方法GB5009.82-2016第一法進行方法對比，結(jié)果無差異，證明該方法可以快速、準確地測定奶粉中維生素E和維生素A的含量。