響應(yīng)面優(yōu)化法微波輔助提取地錦草多糖的工藝研究

吳建麗，王魯豫，張 強(qiáng)，孫云夢(mèng)

(黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

地錦草是藥用價(jià)值很高的植物，研究報(bào)道地錦草化學(xué)成分多達(dá)十幾種，主要有多糖、黃酮、甾體苷等[1]。故其藥理作用也非常多，如：止血、保肝、抗氧化等[2-3]。多糖是一種廣泛存在于自然界生物體的天然功能性高分子化合物，具有抗氧化、抗病毒、抗輻射、等多種生理活性，因此研究天然產(chǎn)物中多糖的提取工藝對(duì)資源的開(kāi)發(fā)與利用意義重大。響應(yīng)面方法[4-6]是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過(guò)試驗(yàn)得到一定的數(shù)據(jù)，采用多元二次方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)化工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法。本文在前期工作[7]的基礎(chǔ)上，就提取中影響多糖得率的幾個(gè)重要因素做了系統(tǒng)研究，并用響應(yīng)面分析法對(duì)地錦草多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)擬合數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了較為相繼的描述，得到了地錦草多糖提取的最佳工藝參數(shù)，以期為地錦草多糖的開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地錦草：采自黃河科技學(xué)院周邊野地，洗凈，曬干，粉碎，過(guò)100目篩，備用；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、濃硫酸、甲醇、乙醇：分析純；石油醚(沸點(diǎn)60～90℃)；5%苯酚，自制；純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004型電子天平：上海良平儀表有限公司；HK-10B500g型搖擺式粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；TL80-1型醫(yī)用離心機(jī)：中國(guó)姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司；JH7230G型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；WBFY-201型微波反應(yīng)器:上海丞明儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 地錦草多糖提取的工藝流程

(1)地錦草石油醚脫脂，甲醇脫色；(3)按照一定的浸泡時(shí)間，微波功率，微波時(shí)間，液料比進(jìn)行提?。?4)提取液離心，收集上清液，回流濃縮，冷卻；(5)濃縮液4 ℃靜置12 h醇沉，3000 r/min離心20 min，棄上清液；(6)轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，純化水定容。(7)配置空白溶液，在490 nm處校正儀器并測(cè)量吸光度。

1.3.2 多糖含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制0、10、20、30、40、50、60μg/mL的葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用苯酚-硫酸法490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度(μg/mL)橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作圖，求得回歸方程為y=0.011x+0.0188，R2=0.9992。

1.3.2.2 地錦草多糖含量的測(cè)定

測(cè)定地錦草提取液中多糖的吸光度值，代入回歸方程計(jì)算多糖濃度，根據(jù)公式計(jì)算：多糖得率(mg/g)=c×V×n/W。式中：c為提取液多糖濃度，mg/mL；V為多糖提取液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；W為地錦草粉末質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 液料比對(duì)地錦草多糖得率的影響

稱取1.000 0 g地錦草5份，液料比分別為30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1 mL/g，加入純化水，設(shè)定浸泡時(shí)間為60 min，微波時(shí)間為40 s，微波功率為240 W。

1.3.3.2 微波時(shí)間對(duì)地錦草多糖得率的影響

稱取1.000 0 g地錦草5份，設(shè)定微波時(shí)間為20、40、 60、 80、100 s，液料比為25∶1 mL/g，浸泡時(shí)間為60 min，微波功率為240 W。

1.3.3.3 微波功率對(duì)地錦草得率的影響

稱取1.000 0 g地錦草粉末5份，設(shè)定微波功率為80、240、400、640、800 W，液料比為25∶1 mL/g，浸泡時(shí)間為60 min，微波時(shí)間為40 s。

1.3.3.4 浸泡時(shí)間對(duì)地錦草多糖得率的影響

稱取1.000 0 g地錦草粉末6份，設(shè)定浸泡時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min，液料比為25∶1 mL/g，微波功率為240 W，微波時(shí)間為40 s。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用D-E軟件處理數(shù)據(jù)，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[5]，選取液料比(A)、微波時(shí)間(B)、微波功率(C)、浸泡時(shí)間(D)為試驗(yàn)因素，以多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)地錦草多糖得率的影響

見(jiàn)圖1。

圖1 液料比對(duì)地錦草多糖得率的影響

試驗(yàn)表明，液料比的增加有利于地錦草中多糖得率的提高，液料比大于42∶1后，多糖得率反而有所降低。原因可能在于溶劑增多利于多糖擴(kuò)散溶出，但是液料比繼續(xù)增加卻導(dǎo)致了其他雜質(zhì)的溶出及部分多糖的分解。因此，液料比選在42∶1左右比較合適。

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)地錦草得率的影響

見(jiàn)圖2。

試驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)增加微波輻射時(shí)間有利于地錦草中多糖得率的提高。當(dāng)微波時(shí)間大于80 s時(shí)，多糖得率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因可能在于微波有利于細(xì)胞膜的破碎而使溶出物增多，但若輻射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，會(huì)使提取體系的部分區(qū)域超聲溫度瞬間上升，多糖分子鏈在高溫時(shí)發(fā)生分解。因此，微波時(shí)間選擇80 s左右較為合適。

圖2 微波時(shí)間對(duì)地錦草得率的影響

2.1.3 微波功率對(duì)地錦草得率的影響

見(jiàn)圖3。

圖3 微波功率對(duì)地錦草得率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，提高微波功率有利于地錦草中多糖得率的提高，但當(dāng)微波功率高于640 W時(shí)，地錦草多糖的提取率反而呈下降趨勢(shì)。原因可能是提高微波功率有利于多糖破壁滲出擴(kuò)散，但功率過(guò)大會(huì)使得供試液劇烈沸騰，液體從錐形瓶中溢出，同時(shí)對(duì)多糖的穩(wěn)定性有一定影響，而使多糖得率降低。因此，微波功率選在640 W左右較為合適。

2.1.4 浸泡時(shí)間對(duì)地錦草多糖得率的影響

見(jiàn)圖4。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)地錦草得率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，浸泡時(shí)間延長(zhǎng)有利于地錦草中多糖得率的提高，但浸泡時(shí)間大于32 min時(shí)，多糖的提取率反倒呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。究其原因，可能是初始溶解時(shí)，多糖伸出兩較大，隨著時(shí)間的推移，多糖溶解達(dá)到飽和，而其他雜質(zhì)溶解量則慢慢上升。因此，浸泡時(shí)間選在32 min左右較為適宜。

2.2 最佳提取工藝的研究

利用Box-Behnken組合設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，選取液料比、微波時(shí)間、微波功率、浸泡時(shí)間為自變量，以地錦草中多糖得率為響應(yīng)值，稱取地錦草粉末1 g，共29份，設(shè)計(jì)四因素三水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。表2為試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理結(jié)果，表3為數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果。

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和計(jì)算結(jié)果

見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

對(duì)表2結(jié)果用D-E8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得二次回歸方程模型為：

Y=-36.94083+0.67667A+1.11525B-0.080067C+0.93617D-0.0238AB+0.0015425AC-0.00905AD+0.000346875BC-0.0006875BD-0.00004CD+0.00933333A2-0.00236042B2-0.00000941667C2-0.00894167D2?；貧w方程方差分析見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

注：*P值小于0.05為差異顯著；**P值小于0.01，表示差異非常顯著；***P值小于0.001，表示差異極為顯著。

從表3可知，模型回歸項(xiàng)F值為3.67，P﹤0.05，說(shuō)明所選模型顯著。各因素的影響大小為液料比﹥微波功率﹥微波時(shí)間﹥浸泡時(shí)間，表中AB的P值小于0.01，說(shuō)明它是較顯著的模型項(xiàng)。模型失擬項(xiàng)P﹥0.05不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.783 4，調(diào)整系數(shù)RAdj2=0.552 6，表明試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合程度高，可用該模型預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。CV(變異系數(shù))=26.67%，說(shuō)明模型精確度高，重現(xiàn)性好，試驗(yàn)可信。

2.3 最佳工藝參數(shù)驗(yàn)證性試驗(yàn)

對(duì)提取率的回歸方程模型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出地錦草中提取多糖的最佳工藝條件為：液料比配制為45 mL/g、微波時(shí)間設(shè)置為60 s、微波功率設(shè)置為483.6 W、浸泡26.2 min，多糖產(chǎn)率的預(yù)測(cè)值為16.02 mg/g。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室儀器參數(shù)，微波功率和微波時(shí)間只能設(shè)置為整數(shù)，最終確定實(shí)驗(yàn)條件為：液料比45 mL/g、浸泡時(shí)間26 min、微波功率480 W、微波時(shí)間60 s。對(duì)修正參數(shù)下條件平進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得地錦草中多糖的實(shí)際提取率為15.81 mg/g，與預(yù)測(cè)值(16.02 mg/g)相比較試驗(yàn)的結(jié)果偏差較小，說(shuō)明二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型進(jìn)行等高線疊加所得到的優(yōu)化區(qū)域符合設(shè)計(jì)目標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)模型具有重現(xiàn)性，通過(guò)本試驗(yàn)方法可以得到地錦草中多糖含量較高的提取工藝。

3 結(jié)論

筆者以地錦草為原料，用微波輔助法水提醇沉提取地錦草多糖。從單因素水平試驗(yàn)可見(jiàn)：液料比為42∶1，微波時(shí)間為80 s，微波功率為640 W，浸泡時(shí)間為32 min時(shí)多糖得率分別最高。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析法試驗(yàn)，得出各因素對(duì)提取率的影響大小為：液料比﹥微波功率﹥微波時(shí)間﹥浸泡時(shí)間，最佳提取條件為液料比45 mL/g、微波時(shí)間60 s、微波功率483.6 W、浸泡26.2 min，多糖最佳提取率的預(yù)測(cè)值為16.02 mg/g。驗(yàn)證性試驗(yàn)進(jìn)一步證明在液料比45 mL/g、浸泡時(shí)間26 min、微波功率480 W、微波時(shí)間60 s時(shí)，地錦草中多糖提取率達(dá)到15.81 mg/g。本試驗(yàn)結(jié)果可為規(guī)?；崛〉劐\草多糖提供一定的參考，更優(yōu)化的提取工藝及多糖的理化的性質(zhì)均有待進(jìn)一步的深入研究。