血小板活化標(biāo)志物、維生素D與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性

陳亮，劉媛，梁林，董娜，劉志忠,2

1.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院檢驗科，北京市100068；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實驗診斷中心，北京市100070

缺血性腦卒中發(fā)病與血小板黏附、聚集率增加密切相關(guān)，因此，缺血性腦卒中患者需要長期規(guī)律服用抗血小板藥物。我國臨床應(yīng)用最多的抗血小板藥物是阿司匹林和氯吡格雷[1]，然而臨床上部分患者應(yīng)用效果欠佳?？寡“逯委熀蟾邭埩粞“宸磻?yīng)性(抗血小板藥物抵抗)增加了再發(fā)缺血性血管事件的風(fēng)險[2-3]。亞洲人中，氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance,CR)發(fā)生率為20%～65%，遠(yuǎn)高于其他人種[4]。

血小板活化是動脈粥樣硬化血栓的標(biāo)志特征之一，血小板活化后血小板聚集率增加，平均血小板體積增大，氧自由基、血栓素和血小板活化因子合成明顯增加。血小板P選擇素又稱CD62p，是一種存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體膜和血小板α顆粒膜上的糖蛋白，主要通過介導(dǎo)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的滾動，以及促使血小板與滾動細(xì)胞的黏附，在炎癥和血栓形成等方面起重要作用[5]。血小板活化受多種因素影響，如高糖[6]、炎癥因子[7]、脂多糖、病毒感染等。近年來，人們發(fā)現(xiàn)25-羥維生素D(25-hydroxyvitamin D,25-OHVitD)具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，除參與經(jīng)典鈣磷代謝調(diào)節(jié)外，還參與免疫調(diào)節(jié)及多種細(xì)胞的分化、增殖。血小板線粒體有維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)表達(dá)，表明維生素D可以通過VDR的線粒體非基因組活性或鈣信號的直接調(diào)制，調(diào)節(jié)血小板活化[8-9]。

基于P選擇素、維生素D與血小板活化的潛在聯(lián)系，我們系統(tǒng)分析它們與缺血性腦卒中患者抗血小板藥物抵抗的相關(guān)性，以期發(fā)現(xiàn)藥物抵抗的預(yù)測因子。

1 資料與方法

1.1 一般資料

連續(xù)收集2017年6月至2018年6月中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院的缺血性腦卒中住院患者190例，均符合中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組制定的中國急性缺血性腦卒中診治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT和MRI證實。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①TOAST分型為動脈粥樣硬化型腦梗死和小動脈閉塞型腦梗死；②患者和家屬知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴阿爾茨海默??；②入院時有發(fā)熱、缺氧、意識障礙及血流動力學(xué)障礙；③對乙酰水楊酸過敏；④近1周內(nèi)有使用除阿司匹林外的非甾體抗血小板藥、低分子肝素、華法林等影響血小板聚集功能的藥物；⑤血小板計數(shù)＞450×109/L或＜100×109/L；⑥并發(fā)較嚴(yán)重的肝、腎功能不全，或腫瘤、免疫系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等疾?。虎呓?個月內(nèi)曾經(jīng)歷手術(shù)或嚴(yán)重外傷。

本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

收集患者的一般情況(年齡、性別、身高、體質(zhì)量等)、既往病史(高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、卒中史等)、個人史(吸煙、飲酒史等)、服藥史、家族史、實驗室檢查和影像學(xué)資料(CT或MRI)。

1.2.2 抗血小板治療

入院后給予吸氧，監(jiān)測血壓、心率等，根據(jù)情況調(diào)整血壓、血糖、血脂，保持呼吸道通暢，進(jìn)行營養(yǎng)支持。符合條件的患者予尿激酶、纖溶酶原激活劑等溶栓治療。

入組患者均按中國急性缺血性腦卒中診治指南進(jìn)行抗血小板治療，即非心源性缺血性卒中患者早期短程使用阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷，此后長期阿司匹林或氯吡格雷單藥治療[1]。阿司匹林(國藥準(zhǔn)字J20130078，Bayer S.p.A)入院時予負(fù)荷劑量300 mg，之后100 mg/d。加服氯吡格雷(國藥準(zhǔn)字H20056410，賽諾菲制藥有限公司)，入院時予負(fù)荷劑量300 mg，之后75 mg/d。3周后予阿司匹林或氯吡格雷單藥治療。

阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷治療7～10 d，采集靜脈血行血小板功能和生化指標(biāo)檢查。

1.2.3 光比濁血小板聚集儀實驗

用2支3.8%枸櫞酸鈉抗凝真空采血管采集靜脈血。血細(xì)胞分析儀測定血漿的血小板濃度，用貧血小板血漿調(diào)整血小板濃度為(200～300)×109/L，檢測血小板聚集率。

應(yīng)用LBY-NJ4A全自動血小板聚集儀(北京泰利康信科技有限公司)以及二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)誘導(dǎo)劑(美國SIGMA公司)，比濁法測定ADP、AA誘導(dǎo)的最大血小板聚集率(maximum platelet aggregation rates,MPAR)。采血后分別加5 μmol/L ADP10 μl、0.5 mg/L AA 13μl，3 h內(nèi)測定MPAR。AA誘導(dǎo)的MPAR≥20%者定義為阿司匹林抵抗(aspirin resistance,AR)，否則為阿司匹林敏感(aspirin sensitivity,AS)；ADP誘導(dǎo)MPAR≥50%者定義為CR，否則為氯吡格雷敏感(clopidogrel sensitivity,CS)[10]。

1.2.4 CD62p活化百分率

使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀及其配套試劑(美國BD公司)。熒光素標(biāo)記抗血小板單克隆免疫熒光染色，陰性對照管中加鼠IgG1-FITC、CD61-PE各20μl，測定管中加入CD62pFITC 20μl，再加入全血5μl。室溫(24～28℃)避光反應(yīng)15 min，立即加入1%多聚甲醛(2～6℃)110 ml混勻，2～8℃陰暗處放置30 min，立即上機獲取數(shù)據(jù)。

1.2.5 血漿P選擇素

血漿500μl凍存，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢CUSABIO生物技術(shù)公司)測定血漿P選擇素濃度。

1.2.6 血液生化指標(biāo)及維生素D

采空腹肘靜脈血4 ml，3000 r/min離心10 min，當(dāng)天檢測。采用全自動生化分析儀(邁瑞B(yǎng)S2000M)檢測血液生化指標(biāo)。采用Cobas e601全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏公司)和配套試劑檢測血清25-OHVitD濃度。25-OHVitD＜10 ng/ml為維生素D缺乏，10～20 ng/ml為維生素D不足，20～30 ng/ml為維生素D臨界，＞30 ng/ml為維生素D營養(yǎng)充足。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料符合正態(tài)分布的，以(xˉ±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以是否發(fā)生CR為因變量，以單因素分析有顯著性差異的變量為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

AR率1.2%，CR率24.7%。由于AR數(shù)量少，本研究只分析CR的相關(guān)因素。

按是否發(fā)生CR將患者分為CR組(n=47)和CS組(n=143)。CR組高血壓患病率高于CS組(P＜0.05)，其他臨床參數(shù)和生化參數(shù)兩組間均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

CR組CD62p活化百分率、25-OHVitD和MPAR均明顯高于CS組(P＜0.01)，P選擇素兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。CR組維生素D缺乏、不足和臨界的患者百分比分別為72%、25%和3%，CS組分別為25%、66%和9%(χ2=44.246,P ＜ 0.001)。

多元Logistic回歸分析顯示，高血壓、CD62p活化百分率是CR的危險因素，25-OHVitD是CR的保護(hù)因素。見表3。

3 討論

高殘留血小板反應(yīng)性與多種因素有關(guān)，包括蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)因素(糖代謝、吸煙、腎功能等影響肝酶或血小板受體表達(dá))和基因組學(xué)因素(細(xì)胞色素酶P450、P2Y12基因多態(tài)性等)等[11]。對于CR患者，可增加氯吡格雷劑量。Wu等[12]對高殘留血小板反應(yīng)性者予雙倍劑量氯吡格雷(150 mg/d)治療，發(fā)現(xiàn)血小板反應(yīng)性顯著降低，而不會增加出血性事件的發(fā)生率。但也有研究顯示[13]，高劑量氯吡格雷無法克服CR。

血小板活化后，α顆粒迅速與血小板膜融合并釋放，使CD62p重新分布于血小板表面，且部分進(jìn)入血循環(huán)中。CD62p是最具特征性的血小板活化標(biāo)志物，血液中CD62p的表達(dá)(可溶性P選擇素)可反映血小板晚期活化狀態(tài)[14]。胡曉芳等[15]研究顯示，CD62p表達(dá)水平與血小板聚集水平呈正相關(guān)。黃濤[16]等發(fā)現(xiàn)，CD62p活化百分率與腦梗死體積呈正相關(guān)，而抗血小板藥可有效抑制血小板活化，降低血小板CD62p表達(dá)。血小板CD62p可能與高殘留血小板反應(yīng)性有關(guān)。

本研究顯示，CR組CD62p活化百分?jǐn)?shù)高于敏感組，提示血小板高活化狀態(tài)是導(dǎo)致藥物抵抗的因素之一。而血漿可溶性P選擇素濃度與氯吡格雷抵抗無關(guān)，一方面由于其反映血小板晚期活化狀態(tài)[14]，另一方面由于內(nèi)皮細(xì)胞被激活，內(nèi)皮細(xì)胞P選擇素表達(dá)上調(diào)[17]，并部分釋放入血，因而不能特異地反映血小板活化狀態(tài)。

表1 CR組和CS組一般情況及危險因素比較

表2 兩組血漿P選擇素、血小板CD62p活化百分率、維生素D及MPAR的比較

表3 CR組的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

維生素D是一種脂溶性維生素，在體內(nèi)主要以25-OHVitD存在，反映維生素D的飲食攝入和皮膚合成[18]。血小板上存在VDR[8]，因而血小板功能受到維生素D影響。維生素D缺乏對止血和血栓形成的不良影響在體外和動物實驗中得到證實。維生素D可以減少纖溶酶原激活劑Ⅰ、組織因子和血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)[19]。本研究顯示，維生素D缺乏在缺血性腦卒中患者中普遍存在，而CR患者尤為突出。

維生素D不足影響血小板功能。與生理鹽水對照組相比，用骨化三醇預(yù)處理健康人和糖尿病患者血小板，能顯著降低ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率[20]。在穩(wěn)定型心絞痛患者中，維生素D水平與平均血小板體積呈負(fù)相關(guān)[21]。而平均血小板體積與冠心病、急性冠脈綜合征、高血壓、腦卒中以及包括死亡率在內(nèi)的不良結(jié)果的增加率或風(fēng)險有關(guān)，平均血小板體積升高是心、腦血管疾病患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物[22]。維生素D降低可能促進(jìn)血小板活化，導(dǎo)致高血小板聚集率。維生素D對血小板CD62p表達(dá)的抑制作用及其分子機制需要進(jìn)一步研究。

血尿酸濃度與血小板反應(yīng)性關(guān)系的研究有不同結(jié)論。尿酸升高是動脈粥樣硬化的危險因素之一。Yildiz等[23]認(rèn)為，高尿酸導(dǎo)致阿司匹林抵抗。Barbieri等[24]認(rèn)為，尿酸濃度不影響阿司匹林、氯吡格雷和替格瑞洛的反應(yīng)性。我們認(rèn)為，患者患病期間，臨床對這些傳統(tǒng)的動脈粥樣硬化因素進(jìn)行了有針對性的治療和控制，醫(yī)療因素改變了患者尿酸基線濃度，從而導(dǎo)致研究結(jié)果的差異。

本研究顯示，高血壓是CR發(fā)生的獨立風(fēng)險因素，與其他關(guān)于中國人群的研究一致[25-26]。

本研究顯示，低維生素D水平、血小板CD62p活化百分率增加是缺血性腦卒中患者發(fā)生CR的獨立風(fēng)險因素。進(jìn)一步研究應(yīng)探索改善這些風(fēng)險因素對氯吡格雷抵抗和卒中后不良事件發(fā)生的影響。