采用PCR-RFLP法鑒別IBDV強(qiáng)毒BC6／85株和弱毒B87株

陳仕怡，陳 媛，賴隆永，李春燕，劉夢茜，袁曉琴，鄭慶禮，許麗惠，王全溪

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

傳染性法氏囊病是由雙股核糖核酸病毒家族的傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的具有免疫抑制性和高度接觸性傳染病[1]；IBDV強(qiáng)毒株會引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷和病變，疫苗株則造成可逆性損傷[2].因此，準(zhǔn)確鑒別強(qiáng)毒株和弱毒株對于制定IBDV的防治策略有著重要意義.目前，檢測IBDV的方法主要有實時熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫組織化學(xué)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)等，但這些方法大多無法有效地區(qū)分不同毒力株的病毒[3-6].限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-restrition fragment length polymorphism，PCR-RFLP)是在PCR和DNA序列分析的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的RFLP技術(shù).DNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后，選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化，可得到特異性電泳圖譜[7].

IBDV結(jié)構(gòu)蛋白VP2是病毒粒子衣殼結(jié)構(gòu)的主要成分，該蛋白為IBDV抗原集中區(qū)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有決定病毒毒力及抗原變異等重要作用；同時，VP2基因具有高變區(qū)，極易突變，也參與決定了IBDV的繁殖力和繁殖速度[8-10].通過建立IBDV強(qiáng)、弱毒株的PCR-RFLP鑒別診斷方法，可為臨床實踐中IBDV強(qiáng)、弱毒株的快速鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種便捷的方法，也可為IBDV的預(yù)防與治療提供依據(jù).

利用PCR-RFLP檢測IBDV的方法較多，目前國內(nèi)多采用SspⅠ作為鑒別vvIBDV的內(nèi)切酶[5].楊蒙等[11]選取AhaⅠ、StuⅠ和BamHⅠ、NspⅠ兩組限制性內(nèi)切酶進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)其能夠分別對超強(qiáng)毒株、強(qiáng)毒株和疫苗株進(jìn)行酶切鑒定.本試驗根據(jù)IBDVVP2基因保守區(qū)設(shè)計一對通用引物和兩個限制性內(nèi)切酶位點(BamHⅠ和PstⅠ)，采用PCR-RFLP分析酶切產(chǎn)物，可以準(zhǔn)確性、高效率鑒別診斷IBDV強(qiáng)毒株和弱毒株.研究結(jié)果可為快速鑒別IBDV強(qiáng)、弱毒株提供可靠的方法.

1 材料與方法

1.1 材料

IBDV弱毒B87株、IBDV強(qiáng)毒BC6/85株及傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)、雞新城疫病毒(newcastle disease，ND)、雞淋巴細(xì)胞性白血病(lymphoid leukosis virus，LLV)、禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)、禽4型腺病毒(fowl adenovirus serotype-4，F(xiàn)AdV-4)、腺病毒的標(biāo)準(zhǔn)陽性核酸，由福州某生物技術(shù)有限公司提供.

病毒RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstⅠ購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 參考GenBank中IBDV B87株和BC6/85株的VP2共保守區(qū)段，通過基因序列分析軟件及引物設(shè)計分析軟件DNAman 6.0、Primer Premier 5.0設(shè)計引物(上游引物：5′-AGGAAGCCTGAGTGAACTGACA-3′；下游引物：5′-TGGCATCAAGACCGTCTGGCC-3′)，預(yù)計目的片段的長度為 856 bp.1.2.2 病毒RNA的提取 按照病毒RNA提取試劑盒操作步驟提取病毒RNA，置-80℃下保存或立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

1.2.3 PCR擴(kuò)增與鑒定 按照常規(guī)反轉(zhuǎn)錄體系和反應(yīng)條件在20 μL體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.反轉(zhuǎn)錄體系和反應(yīng)條件為：2 μL RNA 模板、4 μL 5×反應(yīng)緩沖液、2 μL 25 mmol·L-1氯化鎂、1 μL 隨機(jī)引物、1 μL 寡聚胸腺嘧啶引物、1 μL 10 mmol·L-1PCR核苷酸混合液、1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶、0.5 μL核糖核酸酶抑制劑，用無核酸酶水補(bǔ)足至20 μL，于42℃孵育15 min，72℃加熱15 min.根據(jù)常規(guī)PCR反應(yīng)體系(50 μL)將反轉(zhuǎn)錄所得的產(chǎn)物再用上、下游引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增體系為：2 μL cDNA模板，上、下游引物各2 μL，25 μL 2×PCR預(yù)試劑(含染料)，加無核酸酶水補(bǔ)足至50 μL.反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃擴(kuò)增30 s，這3個步驟循環(huán)35次，最后于72℃延伸10 min，于4℃結(jié)束反應(yīng).取擴(kuò)增完成的PCR產(chǎn)物30 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因片段的大小，與標(biāo)準(zhǔn)的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物，如DL2000 Marker或Trans2K Plus DNA Marker進(jìn)行比較，以查看是否擴(kuò)增出856 bp的特異性片段，與預(yù)計的目的片段是否相一致.

1.2.4 目的基因的回收與測序 按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒的要求回收目的基因，取10 μL送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，與GeneBank上的基因序列進(jìn)行比對.

1.2.5 酶切鑒定 取“1.2.4”中回收的目的基因，用BamHⅠ和PstⅠ酶切，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為：20 μL純化的 PCR 目的片段(≤0.4 μg)、6 μL 10×快切酶緩沖液、1 μL 快切酶BamHⅠ、1 μL 快切酶PstⅠ，用無核酸酶水補(bǔ)足至60 μL，于30℃孵育30 min，再加入PstⅠ孵育2 h.用2%瓊脂糖凝膠電泳(95 V、27 min)鑒定酶切片段的大小.

1.2.6 特異性檢測 按“1.2.3”、“1.2.4”和“1.2.5”的方法檢測正常的雞組織、IBV、IBDV、ND、LLV、ARV和FAdV-4.

1.2.7 敏感性檢測 取IBDV BC6/85株RNA作10的倍比稀釋成2 000、200、20、2、0.2和0.02 pg，各取1 μL分別按“1.2.3”、“1.2.4”和“1.2.5”的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增與鑒定，觀察結(jié)果，確定其最低的檢測量.

1.2.8 重復(fù)性檢測 按“1.2.3”、“1.2.4”和“1.2.5”的方法分別對IBDV BC6/85株和B87株陽性樣本的目的基因進(jìn)行酶切，重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別提取IBDV BC6/85株和B87株的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到大小為856 bp的目的基因條帶(圖1)，與預(yù)計期望得到的擴(kuò)增目的基因條帶片段的大小相一致.

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果及酶切位點

將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并進(jìn)行酶切位點分析.結(jié)果表明，BC6/85株的目的片段具有BamHⅠ和PstⅠ限制性內(nèi)切酶位點，而B87株的目的片段僅有一個PstⅠ限制性內(nèi)切酶位點(圖2、圖3).

圖1 IBDV BC6／85株和B87株VP2基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 RT-PCR amplification products of VP2 gene for IBDV BC6/85 and B87

圖2 IBDV BC6／85株目的片段的酶切位點Fig.2 Restriction site of the target fragment in BC6/85 strain

圖3 IBDV B87株目的片段的酶切位點Fig.3 Restriction site of the target fragment in B87 strain

2.3 酶切鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收目的基因，用BamHⅠ和PstⅠ雙酶切后，IBDV BC6/85株被切出166、242和449 bp大小的3條目的條帶(圖4)，而B87株僅能被PstⅠ切出242和615 bp大小的2條片段(圖5).

圖4 IBDV BC6／85株RT-PCR產(chǎn)物的BamHⅠ、PstⅠ酶切圖譜Fig.4 Restriction map of IBDV BC6/85 cut by BamHⅠand PstⅠ

圖5 IBDV B87株RT-PCR產(chǎn)物的BamHⅠ、PstⅠ酶切圖譜Fig.5 Restriction map of IBDV B87 cut by BamHⅠ and PstⅠ

2.4 特異性檢測結(jié)果

抽提正常雞組織、IBV、NDV、LLV、ARV、FAdV-4及IBDV BC6/85株、B87株的mRNA進(jìn)行PCR-RFLP擴(kuò)增.結(jié)果表明，只有IBDV BC6/85株和B87株的PCR擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)856 bp大小的片段，其他6個樣品沒有出現(xiàn)目的片段(圖6)；同時，只有IBDV BC6/85株和B87株的酶切結(jié)果出現(xiàn)相應(yīng)的酶切圖譜(圖7).可見，本試驗建立的鑒別方法具有較好的特異性.

圖6 PCR特異性檢測結(jié)果Fig.6 Specificity of PCR

圖7 酶切特異性檢測結(jié)果Fig.7 Specificity of enzyme digestion

2.5 敏感性檢測結(jié)果

分別取 1 μL 2 000、200、20、2、0.2 和 0.02 pg BC6/85株的 cDNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，只有 0.02 pg BC6/85株的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后不出現(xiàn)目的片段，其他5個均能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，表明該方法可以檢測到0.2 pg的核酸(圖8).

2.6 重復(fù)性檢測結(jié)果

分別選取3份相同的IBDV BC6/85株和B87株cDNA進(jìn)行PCR-RFLP，BC6/85株3份樣品均在166、242和449 bp處得到清晰可見、與目的條帶一致的片段(圖9)；B87株3份樣品均在242和615 bp處得到與目的條帶一致的片段(圖10).

圖8 酶切敏感性檢測結(jié)果Fig.8 Sensibility of enzyme digestion

圖9 IBDV BC6／85株P(guān)CR重復(fù)性檢測結(jié)果Fig.9 Repeatability of PCR for IBDV BC6/85

圖10 IBDV B87株P(guān)CR重復(fù)性檢測結(jié)果Fig.10 Repeatability of PCR for IBDV B87

3 討論

劉玉鋒[12]研究表明：不同毒力的IBDV毒株致死率不同，感染后3 d，BC6/85株感染組雞群出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀和免疫器官病變，而B87株接種組則未表現(xiàn)出臨床癥狀，非免疫器官也并無損傷；而免疫器官僅在感染后3 d出現(xiàn)輕度損傷，且巨噬細(xì)胞也出現(xiàn)了增加的現(xiàn)象.因此，準(zhǔn)確鑒別強(qiáng)毒株和弱毒株對于制定IBDV的防治策略有著重要意義.

PCR-RFLP在禽類病毒鑒別診斷中的應(yīng)用十分廣泛.唐熠等[13]等采用PCR-RFLP提取病畜血清鑒別Ⅰ群禽腺病毒的12個血清型，該方法具有快速、低成本的優(yōu)勢，提高了腺相關(guān)病毒的臨床診斷和防治效率.本試驗先通過PCR擴(kuò)增目的DNA，之后利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，提高了目的DNA的含量及相對特異性、靈敏度，同時降低了IBDV的檢測成本.

利用本試驗設(shè)計并合成的特異性引物，對兩種IBDV毒株的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，能檢測出一條PCR特異性條帶，擴(kuò)增出的DNA目的片段大小為856 bp，與試驗設(shè)計時預(yù)期的目的片段一致.選取BamHⅠ和PstⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)其能夠?qū)Τ瑥?qiáng)毒株BC6/85和弱毒株B87進(jìn)行酶切，獲得兩種結(jié)果.可見，本試驗采用的這種RT-PCR-RFLP方法能夠較好地區(qū)分兩種毒株，該法特異性強(qiáng)且試驗時間短，為IBDV強(qiáng)毒株和弱毒株的快速鑒別診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供一種新的有效方法，同時為疫苗研發(fā)過程中對疫苗株的驗證和鑒定提供新思路，為IBDV的預(yù)防與治療提供參考.