5種條件下桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達

楊澤慧，陸 芝，李麗紅，江仲鵬，馮錦秀，馮麗貞

(福建農(nóng)林大學林學院，福建福州350002)

麗赤殼屬(Calonectriaspp.)真菌可侵染近100科寄主植物，造成多種病害[1].其中，C.reteaudii是澳大利亞、南美洲以及東南亞等地區(qū)桉樹焦枯病(Cylindrocladium)最重要的致病菌，主要危害巨桉、圓角桉、白桉、赤桉等眾多桉樹品種，病樹葉片焦枯脫落、嫩枝梢枯腐爛，甚至樹冠禿頂和整株死亡，桉樹人工林生產(chǎn)量明顯下降[2].據(jù)估計，福建省每年因該病害造成的經(jīng)濟損失達0.518億元，嚴重制約著桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3].我國桉樹焦枯病的病原菌至少有7種，其中C.pseudoreteaudii是福建省最早發(fā)現(xiàn)、分布最廣且致病力最強的病原菌株[4].對該菌致病調(diào)控機理進行研究，可為設(shè)計藥劑提供靶位點，為制定持久有效的防治策略奠定基礎(chǔ).

MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它與MAPK KK(MAPK kinase kinase)、MAPKK(MAPK kinase)等組成的MAPK級聯(lián)途徑是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導途徑，在真核生物的各項生命活動中具有重要調(diào)控作用[5-7].研究[8]表明，植物病原真菌中至少存在3條典型的MAPK級聯(lián)途徑.酵母Fus3/Kss1類同源基因在植物病原真菌中主要調(diào)控交配、附著胞或其他侵染結(jié)構(gòu)的形成、菌絲侵入生長和毒力；Slt2-MAPK級聯(lián)通路主要參與植物病原真菌的細胞壁完整性；Hog1-MAPK主要應答植物病原真菌細胞的滲透壓脅迫，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)膨壓維持細胞滲透壓的穩(wěn)定[9-11].3條通路間既相互獨立又互相協(xié)作，使病原真菌積極響應環(huán)境變化和寄主的防衛(wèi)反應.

植物在受到病菌侵染時會爆發(fā)活性氧，產(chǎn)生不利于病原菌的生存環(huán)境，以抵御病菌的侵入[12]；也會產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白(幾丁質(zhì)酶和1，3-葡聚糖酶)，瓦解病菌的細胞壁[13].運用殺真菌劑(腐霉利、異菌脲、咯菌腈)防治病原菌時可能會激活Hog1-MAPK通路，導致病原菌不受控制地積累甘油等成分，最終病菌過度吸水腫脹而破裂，因此，病原菌的抗逆性在其侵染過程中十分重要[14].而孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管是病原菌侵入植物的關(guān)鍵步驟.

鑒于此，本研究運用qPCR技術(shù)分析桉樹焦枯病菌C.pseudoreteaudii(YA51)與酵母Fus3/Kss1、Slt2、Hog1和Ime2類基因同源的4個MAPK基因CpKss1、CpSlts、CpHog1和CpIme2在鹽脅迫、氧脅迫、細胞壁干擾物質(zhì)脅迫、桉樹組織誘導以及不同發(fā)育時期5個條件下的表達情況，預測其功能.為該病菌的致病機制、抗逆性機制研究，以及尋求控制該病害的有效途徑奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

桉樹焦枯病菌C.pseudoreteaudiiYA51、桉樹抗焦枯病品系尾細桉M1(Eucalyptus urophylla×E.tereticornis)葉片由福建農(nóng)林大學森林保護研究所提供.YA51基因組已上傳至美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology information，NCBI， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，編號為 MOCD01000000.瓊脂糖(BIOWEST)、PCR 引物(華大基因提供)、β-巰基乙醇、Tris-Hcl、EDTA、NaCl、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純、Taq PCR Master Mix(2×)(Promega)、0.5×TBE緩沖液、多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、Talent熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)、FastQuant cDNA第1條鏈合成試劑盒(FastQuant RT Kit)均采購自天根生化科技(北京)有限公司.

1.2 方法

將焦枯病菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養(yǎng)基上，然后放入28℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d.將培養(yǎng)后的平板刮掉菌絲，24 h后用無菌水清洗PDA平板并制成孢子懸浮液(106個·mL-1)或從菌落邊緣打取6 mm菌碟.

1.2.1 NaCl脅迫處理 將15 mL孢子懸浮液接種于分別含有0、0.1、0.2、0.3、0.4 mol·L-1NaCl的酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium，YPD)培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器(28℃，150 r·min-1)中培養(yǎng)12 h.用4層紗布濾下菌絲，用錫箔紙包裹后液氮速凍，-80℃保存.

1.2.2 干擾細胞壁完整性處理 分別將2個菌碟接種于含0、100、150、200 μg·mL-1熒光增白劑(Calcofluor White，CFW)的100 mL羧甲基纖維素鈉(CMC)培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器(28℃，150 r·min-1)中培養(yǎng)24 h.用4層紗布濾下菌絲，用錫箔紙包裹后液氮速凍，-80℃保存.

1.2.3 氧脅迫處理 分別將2個菌碟接種于含有0、4、6、8 mmol·L-1H2O2的150 mL CMC培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器(28℃，150 r·min-1)中培養(yǎng)24 h.用4層紗布濾下菌絲，用錫箔紙包裹后液氮速凍，-80℃保存.

1.2.4 桉樹組織誘導處理 取2 g桉樹葉片加入2 mL無菌水研磨成漿，離心后取上清液，用細菌過濾器過濾上清液，置于100 mL PDA培養(yǎng)基，搖勻；待凝固后鋪上玻璃紙，在平板中加入100 μL上述孢子懸浮液(106個·mL-1)，并用涂布器均勻涂布.以馬鈴薯葡萄糖液體(potato dextrose broth，PDB)培養(yǎng)基接入焦枯病菌靜置培養(yǎng)作為對照組.分別在12和24 h后，用錫箔紙將菌絲及玻璃紙一同包裹后液氮速凍，放入-80℃冰箱中保存，備用.

1.2.5 不同發(fā)育時期樣品收集 離心收集孢子用錫箔紙包裹后液氮速凍；將15 mL孢子懸浮液接種于150 mL YPD培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器(28℃，150 r·min-1)中，待芽管的長度為孢子長度的1/2時收集萌發(fā)菌絲，待培養(yǎng)12和24 h時收集成熟菌絲，用錫箔紙包裹后液氮速凍，-80℃保存.

1.2.6 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN)試劑盒說明書提取不同脅迫條件下的桉樹焦枯病菌.采用超微量分光光度儀檢測總RNA濃度及D260nm/D280nm，凝膠電泳檢測總RNA帶型.

以mRNA為模板，根據(jù)FastQuant cDNA第1條鏈合成試劑盒(TIANGEN)說明書進行反轉(zhuǎn)錄PCR.第1輪反應體系：5×gDNA Buffer 2 μL，Total RNA 3 μL，RNase-Free ddH2O 補足到 10 μL，加樣后于 42 ℃孵育3 min，再冰浴.接著向 PCR 管中加入事先配置好的 Mix：10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQRT Primer Mix 2 μL、RNase-Free ddH2O，補足到10 μL.反應程序：42 ℃，15 min；95 ℃，3 min，置于-20 ℃冰箱中保存.

1.2.7 熒光定量PCR 以cDNA為模板，根據(jù)TransStart Tip Green RT-qPCR SuperMix(TRANSGEN)說明書進行熒光定量 PCR.反應體系：2×Talent qPCR PreMix 10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.6 μL，Reverse Primer 0.6μL，cDNA 0.3 μL，50×ROX×Reference Dye 0.4 μL，RNase-Free ddH2O 補足20 μL.反應程序：95 ℃ 3 min，95℃ 5 s，60 ℃ 15 s，30 個循環(huán).

采用Beacon Designer7軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程公司合成(表1).陳慧潔等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在桉樹焦枯病菌C.pseudoreteaudiiYA51中相同的內(nèi)參基因在不同試驗條件下的穩(wěn)定性存在差異.因此本研究對不同條件下的內(nèi)參基因進行了篩選，最終分別以β-tubulin(氧脅迫)、α-tubulin-2(桉樹組織誘導)、Ubiquitin(細胞壁干擾物質(zhì)脅迫及鹽脅迫)、β-actin(不同發(fā)育時期)為內(nèi)參基因，計算表達量(Q)：

每個處理設(shè)3個重復.采用SPSS Statistics 19對各基因在相同指標、不同水平下的差異性進行單因素方差分析(P＜0.05).

表1 熒光定量PCR引物Table1 Primers for RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 高滲透壓脅迫下桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達情況

利用qPCR檢測了桉樹焦枯病菌MAPK基因在不同水平的高滲透壓處理下的表達情況，結(jié)果如圖1所示.從圖1可知：4個MAPK基因受鹽脅迫的表達量整體呈現(xiàn)出一個線性增長的表達模式；隨著脅迫強度的增強，表達量增加.其中CpHog1和CpKss1，在NaCl處理濃度為0.1 mol·L-1時顯著上調(diào)表達；當NaCl處理濃度為0.4 mol·L-1時，上調(diào)表達量最大，分別為8.36和6.28倍，且不同水平處理之間均呈顯著性差異.CpSlt2在NaCl處理濃度為0.3 mol·L-1時，才表現(xiàn)出與對照的顯著性差異，呈現(xiàn)出表達量增長的趨勢，此時的相對表達量為2.77，在此之后相對表達量變化趨于平緩，穩(wěn)定在對照的2.7倍左右.對于CpIme2，當處理濃度為0、0.1、0.2 mol·L-1時，相對表達量變化不大；當NaCl處理濃度為0.3 mol·L-1時，CpIme2的表達量最大，比對照上調(diào)了6.97倍；隨著處理濃度的增大，表達量表現(xiàn)出降低趨勢，但較對照顯著增大.綜上所述，不同濃度NaCl處理均有利于MAPK基因的上調(diào)表達，CpHog1和CpKss1相對表達量整體高于CpSlt2和CpIme2，其中CpHog1相對表達量上調(diào)最大.

2.2 氧脅迫下桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達情況

通過qPCR檢測不同水平H2O2處理的桉樹焦枯病菌MAPK基因表達量的變化，結(jié)果如圖2所示.從圖2可知：從整體上看4個MAPK基因受不同濃度氧脅迫下的表達量，呈現(xiàn)出不同的變化趨勢；CpKss1在不同水平H2O2處理下的表達量變化無顯著差異，相對表達量為對照的1.39～1.61倍；CpSlt2的表達量表現(xiàn)出一個線性增長的表達模式，隨著脅迫強度的增大，表達量增加.當H2O2處理濃度為6 mmol·L-1時，CpSlt2開始發(fā)生顯著性上調(diào)表達，此時表達量比對照上調(diào)了2.76倍.當H2O2處理濃度為8 mmol·L-1時，CpSlt2上調(diào)表達量最大，相對表達量為4.29.CpHog1在H2O2處理濃度為4 mmol·L-1時發(fā)生顯著下調(diào)，此時的相對表達量為對照的0.63倍.在H2O2處理濃度為6和8 mmol·L-1時，CpHog1相對表達量變化趨于平緩，穩(wěn)定在對照的1.3倍左右，但與對照無顯著差異.CpIme2受氧脅迫的表達量呈現(xiàn)出一個拋物線的增長表達模式，隨著脅迫強度的增強，在某一濃度達到高誘導表達，隨后表達量減少.當H2O2處理濃度為6 mmol·L-1時，CpIme2表現(xiàn)出顯著上調(diào)，比對照上調(diào)了2.09倍，隨后表達量降低為對照的1.69倍.

圖1 不同濃度NaCl脅迫下桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達量(P＜0.05)Fig.1 Expression levels of MAPK genes in C.pseudoreteaudii under different concentrations of NaCl

圖2 不同濃度H2O2脅迫下桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達量(P＜0.05)Fig.2 Expression levels of MAPK genes in C.pseudoreteaudii under different concentrations of H2O2

2.3 細胞壁干擾物質(zhì)脅迫下桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達情況

桉樹焦枯病菌MAPK基因在不同水平CFW處理下的表達量變化如圖3所示.從圖3可知：從整體上看4個MAPK基因受不同濃度CFW脅迫下的表達量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢；CpKss1的表達量隨CFW脅迫強度的增大呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢.當CFW處理濃度為100 μg·mL-1時，CpKss1的相對表達量發(fā)生顯著上調(diào)，此時的相對表達量為對照的1.18倍；當CFW處理濃度為150和 200 μg·mL-1時，CpKss1 相對表達量變化趨于平緩，穩(wěn)定在對照的0.8倍左右.CpSlt2表達量表現(xiàn)出一個線性增長的表達模式，隨著脅迫強度的增大，表達量增加；當CFW處理濃度為150 μg·mL-1時，CpSlt2開始發(fā)生顯著上調(diào)表達，此時比對照上調(diào)了2.10倍.當CFW處理濃度為200 μg·mL-1時，CpSlt2上調(diào)表達量最大，相對表達量為4.53.CpHog2在不同水平CFW處理下的表達量呈輕微下調(diào)，但表達量變化無顯著差異，相對表達量為對照的0.78～0.86倍.CpIme2的表達量呈現(xiàn)出線性下降的表達模式，隨著脅迫強度的增大，表達量降低；在CFW處理濃度為100 μg·mL-1時出現(xiàn)顯著下調(diào)表達，此時的表達量是對照的0.65倍.當CFW處理濃度為200 μg·mL-1時，下調(diào)表達量最低，為對照的0.49倍.

圖3 不同濃度CFW脅迫下桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達量(P＜0.05)Fig.3 Expression levels of MAPK genes in C.pseudoreteaudii under different concentrations of CFW

2.4 桉樹組織誘導下焦枯病菌MAPK基因的表達情況

桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達量受桉樹組織誘導時間影響的結(jié)果如圖4所示.從圖4可知，從整體上看，不同侵染時間下4個MAPK基因在侵染條件下的表達量變化趨勢不一，有的呈現(xiàn)出上調(diào)的變化趨勢，有的呈現(xiàn)出下調(diào)的變化趨勢.其中，CpKss1受誘導的表達量呈現(xiàn)線性增長，隨著侵染時間的推移，表達量增大.侵染12 h時，表達量顯著上調(diào)，達到2.45；侵染24 h時，CpKss1表達量是對照的3.20倍.不同侵染時期，CpSlt2表達量輕微上調(diào)，但差異不顯著，相對表達量為對照的1.20和1.63倍.CpHog1在侵染條件下發(fā)生顯著下調(diào)，侵染12 h的表達量為對照的0.54倍；侵染時間增加到24 h時，CpHog1的表達量較12 h時輕微上調(diào)，但是較對照依然是顯著下調(diào)，表達量為0.68.CpIme2的表達量變化情況與CpHog1相似，侵染12 h后的表達量為對照的0.47倍，下調(diào)幅度較CpHog1大；當侵染時間增加到24 h時，CpIme2的表達量是對照的0.51倍.

2.5 不同發(fā)育時期桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達情況

不同發(fā)育時期桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達量變化如圖5所示.從圖5可知，從整體上看4個MAPK基因的表達量在不同發(fā)育時期的變化趨勢較為一致，在孢子時期的表達量較低，在萌發(fā)時期的表達量最低，在菌絲1時期的表達量較高，在菌絲2時期的表達量最高.在萌發(fā)時期CpKss1的表達量是孢子時期的0.29倍，表達量變化較其他3個基因大；而CpHog1表達量為0.48.但所有MAPK基因表達量與孢子時期均無顯著差異.在菌絲1時期，4個MAPK基因的表達量均呈上升趨勢；除CpHog1的表達量與孢子時期無顯著差異外，其他3個基因的表達量均在5.7以上，且與孢子時期的表達量表現(xiàn)出顯著差異.隨著菌絲發(fā)育時間的推移，在菌絲2時期4個MAPK基因的表達量均大于菌絲1時期，且與孢子時期和菌絲1時期均表現(xiàn)出顯著差異，其中CpIme2表達量增加到20.40.

圖4 不同侵染條件下桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達量(P＜0.05)Fig.4 Expression levels of MAPK genes in the infected C.pseudoreteaudii

圖5 不同發(fā)育時期桉樹焦枯病菌MAPK基因的表達量(P＜0.05)Fig.5 Expression levels of MAPK genes in C.pseudoreteaudii at different developmental stages

3 小結(jié)與討論

MAPK級聯(lián)途徑在細胞過程中廣泛發(fā)揮作用，常參與病菌的致病過程.CpKss1是酵母Fus3/Kss1類同源基因，在鹽脅迫下受誘導的表達量隨脅迫強度的增大持續(xù)上調(diào)表達，由此可見CpKss1在桉樹焦枯病菌抵御高滲環(huán)境中起重要作用；在氧脅迫下表達量無顯著性變化，表明CpKss1對氧脅迫不敏感；在細胞壁干擾物質(zhì)脅迫下表現(xiàn)出表達量下調(diào)的趨勢，表明CpKss1的表達受到CFW的抑制；在桉樹組織液誘導下隨誘導時間的增加，CpKss1的表達量持續(xù)增加，表明其可能在桉樹焦枯病菌致病過程中發(fā)揮重要作用；CpKss1在菌絲發(fā)育階段表達量最高，且隨菌絲生長時間的推移表達量增加，推測該基因可能參與調(diào)控菌絲的生長發(fā)育.因此，CpKss1在桉樹焦枯病菌中可能參與調(diào)控致病性、菌絲生長、高滲脅迫反應等.研究[17]表明，在玉米黑粉病菌(Ustilago maydis)中有2個酵母Fus3/Kss1類同源基因Kpp2和Kpp6，其雙敲除突變體不能交配且不致病.在黃瓜炭疽病菌[18]和玉米黑粉病菌[17]中，F(xiàn)us3/Kss1-MAPK均被證實與附著胞形成有關(guān).這與本文研究結(jié)果一致.但有研究表明Fus3/Kss1對附著胞的形成無影響.不形成附著胞的病菌敲除Fus3/Kss1同源基因后，禾生球腔菌不能穿透氣孔[19]，小麥葉斑病菌不能產(chǎn)生侵染結(jié)構(gòu)[20]，間接調(diào)控病菌的致病性.

CpSlt2是酵母Slt2類同源基因，在鹽脅迫下表達量輕微上調(diào)，但無明顯規(guī)律.在氧脅迫下隨H2O2濃度的增大，CpSlt2表達量呈直線上升，表明其可能在桉樹焦枯病菌抵御氧脅迫環(huán)境中起重要作用.在細胞壁干擾物質(zhì)脅迫下，CpSlt2受誘導的表達量呈現(xiàn)出持續(xù)增長的表達模式，說明該基因可能參與調(diào)控細胞壁的完整性.在桉樹組織誘導下CpSlt2的表達量無明顯變化，表明其可能與致病性無關(guān)；在病菌的不同發(fā)育階段，CpSlt2在菌絲發(fā)育階段表達量最高，該基因可能與菌絲的生長發(fā)育有關(guān).總而言之，CpSlt2在桉樹焦枯病菌中可能參與調(diào)控氧脅迫反應、細胞壁完整性和菌絲生長發(fā)育等.研究[21]表明，酵母Slt2類同源基因在禾谷鐮刀菌、稻瘟病菌和禾生球腔菌中，都與病菌的細胞壁強度有關(guān).白菜黑斑病菌的酵母Slt2類同源基因被破壞后，菌絲生長緩慢，說明該基因?qū)z生長有一定影響[22].上述研究與本研究結(jié)果具有一致性.在黃瓜炭疽病菌中Slt2類同源基因MAF1調(diào)節(jié)早期侵入步驟，缺失MAF1突變體的芽管無法產(chǎn)生附著胞[23]，這與本文研究結(jié)論存在偏差，可能是由于Slt2類同源基因作用在不同病菌中存在差異[24].

CpHog1是酵母Hog1類同源基因，在鹽脅迫下受誘導的表達量呈現(xiàn)出持續(xù)增長的表達模式，隨著脅迫強度的增大，表達量持續(xù)顯著上調(diào)，推測CpKss1在桉樹焦枯病菌抵御高滲環(huán)境中起重要作用.在氧脅迫和細胞壁干擾物質(zhì)脅迫下，CpHog1的表達量無顯著性變化，表明其可能與抵御氧脅迫反應和調(diào)控壁細胞完整性無關(guān)；在桉樹組織誘導下，CpHog1表達量表現(xiàn)出下調(diào)趨勢，表明CpHog1的表達受到桉樹組織的抑制；在桉樹焦枯病菌的不同發(fā)育時期，CpHog1在孢子萌發(fā)時期表達量最低，在菌絲時期表達量較高，但無明顯規(guī)律.因此，CpHog1在桉樹焦枯病菌中可能參與病菌抵御高滲環(huán)境反應.研究[25-26]表明，該基因在板栗疫病菌和稻平臍蠕孢中均與病菌抵御高滲透壓脅迫有關(guān).與此同時，有研究發(fā)現(xiàn)Hog1同源基因在禾生球腔菌中還與致病性有關(guān)[27].上述研究與本研究結(jié)論一致.

CpIme2是酵母Ime2類同源基因，在鹽脅迫中表現(xiàn)出拋物線型的表達模式，在NaCl濃度較低的情況下CpIme2的表達量持續(xù)上升，但在濃度較大時的表達量較之前略微下降，表明CpIme2在一定程度上參與病菌的高滲脅迫反應.在氧脅迫的條件下，CpIme2的表達量無明顯變化，可能其與病菌抵御氧脅迫反應無關(guān).在細胞壁干擾物質(zhì)脅迫下，CpIme2的表達量呈現(xiàn)出持續(xù)降低的表達模式，表明該基因在CFW脅迫下的表達受到抑制.在桉樹組織誘導培養(yǎng)基上CpIme2的表達量受到抑制.在桉樹焦枯病菌的不同發(fā)育時期，CpIme2在菌絲時期的表達量顯著增加，隨菌絲發(fā)育時間的延長，其表達量也顯著增加，推測該基因在菌絲發(fā)育方面發(fā)揮顯著作用.因此，CpIme2在桉樹焦枯病菌中可能參與病菌的高滲脅迫反應和菌絲的生長發(fā)育.酵母Ime2類同源基因在玉米黑粉病菌中影響菌絲的形成和交配，并間接與致病性相關(guān)[28]，這與本研究結(jié)論相一致.但研究[28]也發(fā)現(xiàn)，Ime2同源基因在真菌中不僅調(diào)控減數(shù)分裂，也調(diào)控各種生理過程，包括子囊孢子形成、假菌絲生長和有性繁殖.

綜上所述，在高滲透壓脅迫下，CpHog1和CpKss1的表達量先表現(xiàn)出顯著增加，但CpHog1增加的幅度明顯大于CpKss1，CpIme2的表達量在脅迫濃度較大時才表現(xiàn)出顯著增加.在細胞壁干擾物質(zhì)脅迫下，CpKss1、CpHog1和CpIme2的表達量受到顯著抑制，其中對CpIme2的抑制程度最大，而對CpHog1和CpKss1的抑制程度相當.在侵染條件下，CpHog1和CpIme2的表達量受到顯著抑制，CpIme2的表達量受抑制程度更大.在不同發(fā)育時期條件下，桉樹焦枯病菌4個MAPK基因均在孢子萌發(fā)階段表達量最低，在孢子時期表達量較低，在菌絲階段表達量最高.其中，CpIme2的表達量變化倍數(shù)最大，CpHog1的表達量變化倍數(shù)最小.