抗疲勞肽的研究進展

王培鑫， 陳悅宇， 王 睿， 林佳馨， 曾紅亮，2， 鄭寶東，2， 張 怡，2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院；2.中愛國際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計研究中心，福建福州350002)

生物活性肽(bioactive peptides)是一類具有多種生物活性的多肽的總稱，能夠調(diào)節(jié)生物機體的生命活動以及生理活性.生物活性肽不僅種類豐富、功能繁多，而且應(yīng)用廣泛，對于食品、飼料和醫(yī)藥等行業(yè)有著重要的貢獻[1].抗疲勞肽(anti-fatigue peptides)不僅能夠供給人體必需氨基酸，并且能夠維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性、提高機體酶的活性、提高機體抗氧化能力、維持神經(jīng)遞質(zhì)的平衡等，具有較大的研究價值.抗疲勞肽延遲或消除疲勞的主要渠道是消除疲勞物質(zhì)的積累，并且提高運動耐力，促進機體恢復(fù)體力.此外，抗疲勞肽具有易于吸收的特點.從事體力、體育、腦力工作的人群極易疲勞，抗疲勞肽的研究對其有重要的意義.抗疲勞肽將成為食品行業(yè)舉足輕重的一種功能性食品的基料[2].

當機體的體力活動或腦力活動進行一段時間，達一定階段后發(fā)生了錯綜復(fù)雜的生理變化，這種狀態(tài)稱為疲勞，對于人體來說是一種正常的生理現(xiàn)象[3].它既可能標志著機體工作能力的暫時性降低，又可能是機體到達疾病的一種預(yù)示[4].隨著時代的發(fā)展，人們每天的工作幾乎都伴隨著疲勞的到來，因而疲勞與生活息息相關(guān)[5].目前，我國對抗疲勞功能性食品的研究仍不成熟，與一些發(fā)達國家相比，在原料制備、分離純化等工藝方面仍較為落后，從而造成提取含量低、難以被吸收利用等問題，對其功效的發(fā)揮也產(chǎn)生了一定的影響.近幾年，國內(nèi)對于抗疲勞肽的研究仍不夠深入，對于抗疲勞肽在抗疲勞肽功能性食品上的應(yīng)用仍具有相當大的前景.

目前，食品行業(yè)內(nèi)對生物活性肽研究較多的是結(jié)構(gòu)特性及生理功能，與其相關(guān)的報道也較為常見.但國內(nèi)對抗疲勞肽的研究還不多見.本文綜述了抗疲勞肽的研究進展，以期為食品行業(yè)對抗疲勞肽的研究提供依據(jù).

1 抗疲勞肽的來源

抗疲勞肽不僅能夠緩解疲勞，還能夠提高運動耐力，是一種重要的生物活性肽.近年來，人們對生物活性肽保健功能的重視度不斷提高，社會對抗疲勞功能食品需求增加，抗疲勞肽的研究受到了廣泛的重視[6，7].對抗疲勞肽的研究目前多集中于從動植物身上提取得到的活性物質(zhì)，其中陸生抗疲勞物質(zhì)來源有鹿茸、牛乳、枸杞、刺五加、天山馬鹿血、紅景天、金針菇、靈芝、人參、丹參、玉米、大豆、小麥、花粉、猴頭菇、西洋參、豬皮等；水生抗疲勞物質(zhì)來源有草魚、鮟鱇魚、牡蠣、秋刀魚、中華鱉、刺參、海參、南極磷蝦、海龍、海馬、海星、霞水母、鮐魚、扇貝、螺旋藻等(表1).

表1 抗疲勞肽的來源Table 1 The sources of anti-fatigue peptides

2 抗疲勞肽的制備

2.1 生物活性肽的常用制備方法

2.1.1 溶劑提取法 目前食品行業(yè)制備生物活性肽采用比較多的方法是溶劑提取法，即以適當?shù)木彌_液充分溶解原料后離心除去不溶性雜質(zhì)，通過一定方法使蛋白質(zhì)沉淀，例如添加蛋白質(zhì)變性劑、調(diào)節(jié)pH等，然后離心除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)，最后分離純化樣品液以獲得目標生物活性肽，主要的分離純化技術(shù)有液相色譜、分子篩層析等.Adebayo et al[14]以二氯甲烷和甲醇混合溶液為溶劑從巴戟青岡葉中提取出了多肽.孫紅娜[15]以茶樹菇為原料，以水為提取溶劑，以溶劑提取法來提取降血壓活性肽，并且對水提法提取工藝進行優(yōu)化，最后得到的最佳提取工藝條件為：溫度30℃，pH為8，提取時間9 h，在此提取條件下，蛋白質(zhì)提取率達到了88.3%，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制率達到了49.3%.

2.1.2 化學(xué)水解法 化學(xué)水解法的主要原理是在水浴條件下向待降解蛋白質(zhì)中加入適當濃度的強酸或強堿溶液破壞蛋白質(zhì)的肽鍵，進而控制水解程度，反應(yīng)一定時間后終止反應(yīng)，并對其進行分離純化.化學(xué)水解法具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點，但是又具有許多缺點，例如堿試劑容易損害氨基酸、水解程度不好控制、副產(chǎn)物較多，而且水解結(jié)束需將堿除去，這些缺點限制了該方法的應(yīng)用和推廣.喬偉等[16]以大豆分離蛋白為原料，通過鹽酸水解制備飼料小肽，結(jié)果表明，酸水解明顯受反應(yīng)溫度和時間影響，其最適宜的反應(yīng)條件是溫度90℃、反應(yīng)時間5 h，最后測得終產(chǎn)物二肽、三肽含量為19.38%.

2.1.3 酶解法 酶解法是制備生物活性肽最簡單易用也最常用的方法.不僅具有成本低廉、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)容易控制、產(chǎn)品安全性高等優(yōu)點，并且通過酶的專一性還可以生產(chǎn)特定肽，滿足市場的需要.酶解法中，蛋白酶選擇的合理性是關(guān)鍵，不僅要求酶切特定位點得到特定的肽段，而且還需確保其安全性.酶解法常用的蛋白酶有堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶.曾婷[17]以大豆分離蛋白為原料，使用酶解法制備大豆抗氧化肽，并對酶解條件進行了優(yōu)化.Abeyrathne et al[18]采用酶解法酶解軟黏蛋白制備其水解肽，并探究其最佳酶解條件.

2.1.4 微生物發(fā)酵法 微生物發(fā)酵法的原理是選擇適當?shù)木N，微生物發(fā)酵時會產(chǎn)生一定的蛋白酶系，原料中含有生物活性肽片段的蛋白質(zhì)受到蛋白酶系的作用而分解.同時，微生物發(fā)酵法能夠降低或者消除苦味.進行分離純化后可以省略“脫苦”步驟，不僅能夠簡化工藝，還能降低成本，對于營養(yǎng)價值破壞較小，在保持營養(yǎng)價值方面有相當大的潛力.牟金秀[19]使用微生物發(fā)酵法制備玉米肽，并且對制備工藝條件進行優(yōu)化，繼而對玉米肽功能進行進一步的探索.

2.1.5 化學(xué)合成法 化學(xué)合成法的主要原理是按照目標生物活性肽的原有序列，以適當?shù)幕瘜W(xué)方法合成生物活性肽.依據(jù)合成介質(zhì)的不同，可以將化學(xué)合成法分成固相合成和液相合成兩種.液相合成法的適用范圍主要是小分子肽濃縮多肽片段的合成.固相合成法所使用的固相載體有利于合成中肽鏈的固定、環(huán)化、去保護和純化，但化學(xué)合成法也有許多缺點，例如成本高昂、副反應(yīng)及化學(xué)殘留嚴重，使其在規(guī)?；a(chǎn)的應(yīng)用上受到限制.徐秋霞[20]通過化學(xué)方法合成谷胱甘肽，其合成的路線方針是先將半胱氨酸和甘氨酸反應(yīng)合成Cys-Gly二肽，再與谷氨酸結(jié)合形成三肽Glu-Cys-Gly.

2.1.6 基因重組法 基因重組法對于技術(shù)水平要求較高，需要投入大量的時間與資金進行研發(fā)，研發(fā)階段要求很高.但是假如成功構(gòu)建一個重組基因體系，就可以以相對較為廉價的原料發(fā)酵大批量生產(chǎn)目標生物活性肽.若研究成功，對生物活性肽的研究將會產(chǎn)生重要的影響.時春風(fēng)[21]通過基因重組法人工合成分子質(zhì)量為6.27 ku的rLj-RGD4肽，并發(fā)現(xiàn)rLj-RGD4能夠抑制腫瘤增長與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性步驟，例如增殖、黏附、遷移、浸潤及細胞偽足的形成，并且能夠誘導(dǎo)B16細胞發(fā)生凋亡，加大對其研究對我國抗腫瘤藥物的研發(fā)具有重要的意義.

2.1.7 酶合成法 酶合成法的原理主要是通過酶催化氨基酸及其衍生物合成生物活性肽.酶合成法具有許多優(yōu)點，例如反應(yīng)條件溫和且能夠控制酶催化位置的方向，但是也有許多缺點，例如反應(yīng)過程副產(chǎn)物產(chǎn)生嚴重、生產(chǎn)效率低下、缺乏最適酶等，這些缺點對其發(fā)展產(chǎn)生不利的影響.曹賽等[22]通過染色體整合表達古菌乙?；负铣蒒-末端乙?；叵匐摩?，具有多種重要生物學(xué)功能.

2.2 抗疲勞肽的制備

酶解法不僅能夠生產(chǎn)大量的小肽，而且成本低廉、反應(yīng)過程較為安全、對環(huán)境的危害較小，因而成為目前制備抗疲勞肽的最主要方法.Xu et al[23]通過堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶相結(jié)合酶解玉米蛋白粉制得高F值寡肽，并對其進行了抗疲勞作用研究.Huang et al[24]通過木瓜蛋白酶酶解制備帶魚水解肽，研究其亞鐵螯合物的抗疲勞活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帶魚水解肽亞鐵螯合物能夠顯著降低小鼠丙二醛、血乳酸含量，延長小鼠力竭游泳時間.Hao et al[25]以中性蛋白酶酶解牡蠣制備牡蠣多肽，并且通過小鼠力竭游泳試驗研究其體內(nèi)抗疲勞活性，發(fā)現(xiàn)試驗組小鼠游泳時間比對照組延長了78%.Pan et al[26]以胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解牛乳蛋白制備多肽溶液，并通過負重游泳時間、血清尿素氮、血乳酸和肝糖原等指標對其抗疲勞活性進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗疲勞活性.

3 抗疲勞肽的分離純化

生物活性肽進行分離純化的目的主要是獲得活性更高或純度更高的樣品，并盡可能提高產(chǎn)品得率.生物活性肽的研究中，結(jié)構(gòu)分析、構(gòu)效關(guān)系是較為重要的部分，其研究都需要借助分離純化技術(shù)，因而分離純化對于生物活性肽的研究極其重要.定向分離純化技術(shù)主要包括電泳技術(shù)、層析技術(shù)、膜分離技術(shù)等.

3.1 電泳技術(shù)

電泳是一種電場中帶電粒子向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象.蛋白質(zhì)電泳技術(shù)分離純化的主要原理是利用蛋白質(zhì)樣品各蛋白質(zhì)組分的電泳遷移率、靜電荷不同以及分子大小和形狀各異等特性而進行分離的.在目前實驗室使用分離技術(shù)中，電泳技術(shù)仍然占據(jù)著重要的地位，電泳技術(shù)主要包括毛細管電泳、雙向電泳、脈沖場電泳等(表2).

表2 電泳技術(shù)的類型Table 2 The types of electrophoresis technique

3.2 層析技術(shù)

行業(yè)內(nèi)應(yīng)用較多的層析技術(shù)主要有大孔樹脂吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、反相高效液相色譜法幾種(表3).層析法在醫(yī)藥及生化行業(yè)應(yīng)用非常廣泛，其中反相高效液相色譜法是最為廣泛的一種分離技術(shù).在肽的純化中，反相高效液相色譜法(reversed-phase high performance liquid chromatog，RP-HPLC)是最常用也最高效的方法.

表3 層析技術(shù)的類型Table 3 The types of chromatography technique

3.3 膜分離技術(shù)

膜分離技術(shù)分為微濾、超濾和納濾等3種方法(表4).膜分離技術(shù)在食品、醫(yī)藥、生物行業(yè)具有重要的地位.

表4 膜分離技術(shù)的類型Table 4 The types of membrane separation technique

在實際的應(yīng)用當中，僅僅通過一種方法難以達到想要的效果，因而更多的是采用多種方法聯(lián)用，不僅能夠提高分離效果，而且能夠?qū)崿F(xiàn)生物活性肽多級分離.劉金偉[40]采用超濾法、離子交換層析法分離純化高F值寡肽，并對其進行了抗疲勞性研究.李鴻梅[41]采用葡萄糖凝膠、高效液相色譜法分離純化玉米肽，發(fā)現(xiàn)玉米肽能夠延長小鼠游泳時間，降低小鼠血尿素氮和血乳酸水平，具有較好的抗疲勞活性.李素萍[42]以牛乳酪蛋白為原料，經(jīng)胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解后，通過Sephdax G-15凝膠層析粗分，用RP-HPLC的方法加以鑒定，證實了乳源免疫調(diào)節(jié)肽具有抗疲勞活性.曹向宇[43]通過超濾、凝膠過濾色譜分離、離子交換層析、反向高效液相色譜等方法分離純化麥麩多肽液，最終得到2個組分，其中組分1具有較高的自由基清除力，對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率別為58.32%和69.89%.郭平[44]酶解玉米醇溶蛋白后，采用超濾、葡萄糖凝膠層析和離子交換層析等方法分離純化玉米肽，得到優(yōu)勢組分C2b，其測定清除DPPH能力為21.34%.

4 抗疲勞肽的序列鑒定

測定抗疲勞肽的序列對于研究其功能及性質(zhì)具有重要的意義，測定抗疲勞肽的序列也是目前生物活性肽科學(xué)研究中的重要內(nèi)容之一.質(zhì)譜法是測定抗疲勞肽序列的最主要的方法，常與反相高效液相色譜聯(lián)用.在質(zhì)譜分析中，樣品經(jīng)過離子化后進行分離的依據(jù)是離子質(zhì)荷比(m/z)，通過測量不同離子譜峰的強度進行分析.早在1980年代，基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix-assist laser desorption ionization，MALDI)和電噴霧電離技術(shù)(electrospray ionization，ESI)就受到了廣泛的重視.基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)測定的分子質(zhì)量上限為400 ku，對鹽分的耐受性較大.電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)測定的分子質(zhì)量上限為150 ku，分辨率較高，常與液相色譜聯(lián)用.近幾年串聯(lián)質(zhì)譜儀的發(fā)展，使質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)分析的功能進一步加強，能夠更加迅速、靈敏地測定多肽的氨基酸序列，鑒定側(cè)鏈的修飾位點以及確定二硫鍵的位置.劉丹等[45]以液質(zhì)聯(lián)用(RP-HPLC在線連接ESI-MS/MS)測得具有抗疲勞活性的秋刀魚蛋白肽的兩個優(yōu)勢組分PSPHs-C2及PSPH-C3的氨基酸序列，分別為His-Gly-Glu-Glu和Ser-Gly-Ala-Ala-Met.

5 抗疲勞肽的功能評價方法

5.1 抗疲勞運動耐力試驗

5.1.1 小鼠爬桿試驗 小鼠的爬桿時間可用來評價小鼠的疲勞程度.一般小鼠爬桿試驗的方法為：定期灌胃小鼠一段時間后，對小白鼠進行爬桿試驗.將光滑有機玻璃桿置于距離地面一定高度處通過一定裝置將上端固定，下端懸空，將小鼠放在玻璃桿上，此時小鼠肌肉處于緊張狀態(tài)，小鼠到達疲勞狀態(tài)時會從桿上滑落下來，以小鼠的爬竿時間作為疲勞的評價指標.羅翔丹等[46]發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽能夠提高小鼠爬桿的時間.張玉萍等[47]通過小鼠爬桿試驗評價電裂解大豆肽的抗疲勞活性，發(fā)現(xiàn)其能顯著延長小鼠爬桿時間，增加小鼠運動過程中肝糖原和肌糖原含量，減少血清尿素氮的含量、血清乳酸的增加量，最后得到電裂解大豆肽具有顯著的抗疲勞作用的結(jié)論.Ding et al[48]通過小鼠爬桿試驗評價水母膠原蛋白水解肽的抗疲勞活性，發(fā)現(xiàn)處理組的小鼠的爬桿時間均比對照組長，血乳酸、血尿素氮含量比對照組低，糖元含量高于對照組，具有良好的抗疲勞活性.

5.1.2 小鼠游泳試驗 小鼠的負重游泳力竭時間可用來評價小鼠的疲勞程度.一般小鼠游泳試驗的方法為：定期灌胃小鼠一段時間后，對其進行負重游泳試驗.給小鼠的右側(cè)臀負荷適當重量的鉛片，置于適當尺寸、水溫的水槽中游泳，將小鼠從入水游泳至力竭的時間記錄下來.小鼠游泳力竭的判定標準為沒入水面7s不再上浮.Chen et al[49]為研究維生素B對人參皂苷的抗疲勞性的影響，定期給小鼠灌胃人參皂苷一段時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人身皂苷可以延長小鼠游泳時間，降低血乳酸、血尿素氮含量，具有抗疲勞作用，而B族維生素可顯著降低抗疲勞作用，對人參皂苷Re的生物利用度有著一定的削弱作用.Wang et al[50]從豬的脾臟中分離出來一個十肽CMS001，并對其對小鼠負重游泳時間的影響展開了研究，發(fā)現(xiàn)定期灌胃該物質(zhì)能延長小鼠的負重游泳時間，并且降低血尿素氮水平，并降低血液中的乳酸積累，進一步表明其具有抗疲勞作用.Nam et al[51]通過小鼠力竭游泳模型研究了發(fā)酵豬胎盤中甘氨酸—亮氨酸和亮氨酸—甘氨酸二肽的抗疲勞活性，發(fā)現(xiàn)甘氨酸—亮氨酸和亮氨酸—甘氨酸二肽具有較好的抗疲勞活性，在抗疲勞劑的市場上具有較大的應(yīng)用前景.

5.2 常用的抗疲勞生化指標

常用的抗疲勞生化指標包括血清肌酸激酶、血乳酸、血尿素氮、血睪酮、糖元等，測定運動疲勞時各指標含量，可以用作評價疲勞程度及恢復(fù)程度(表5).

6 抗疲勞肽的作用原理

6.1 疲勞的發(fā)生機制

1982年第五屆國際運動生化會議上提出：疲勞是指機體已經(jīng)無法維持原有的運動強度持續(xù)進行某一特定水平上的運動.Lee et al[70]認為疲勞是在同等工作強度下工作一段時間后機體的工作能力下降、能量供應(yīng)不足的一種狀態(tài).疲勞的主要特征體現(xiàn)為運動能力迅速下降，做功以及力量不能維持在原有的水平、工作效率降低、失誤及事故增多、體力減退[71].人體處于疲勞狀態(tài)時，如果不及時恢復(fù)，逐漸積累，則可能會引起“慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)”、“過度訓(xùn)練綜合癥”等，導(dǎo)致機體內(nèi)分泌失調(diào)、免疫力下降，甚至?xí)T發(fā)疾病，威脅人類健康.從相關(guān)研究來看，疲勞的發(fā)生機制主要有以下幾點.

機理一：能源物質(zhì)耗竭學(xué)說.該學(xué)說認為引發(fā)疲勞的原因是運動時體內(nèi)ATP、CP、脂肪和糖元等能源物質(zhì)被大量消耗[72].Qi et al[73]也認為糖元的消耗、血糖水平的下降是機體疲勞的重要影響因素.因為機體ATP和CP的含量有限，長時間運動主要消耗糖和脂肪，而持續(xù)長時間運動糖會大量消耗糖元物質(zhì)，糖元物質(zhì)及血糖含量急劇下降，機體能源物質(zhì)供給不足，導(dǎo)致機體器官功能下降，進而導(dǎo)致機體疲勞.

機理二：疲勞物質(zhì)蓄積學(xué)說.隨著疲勞的加深，肌肉或血液中的乳酸、丙酮酸等酸性物質(zhì)會不斷增加，因而有人提出疲勞產(chǎn)生的原因是肌肉收縮、腺體分泌、神經(jīng)沖動傳遞等生理過程重復(fù)進行時，物質(zhì)代謝產(chǎn)生的一些疲勞物質(zhì)蓄積[74].

表5 抗疲勞指標Table 5 The index of antifatigue

機理三：中樞遞質(zhì)失衡.多巴胺是腦內(nèi)中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，而5-羥色胺是抑制性神經(jīng)遞質(zhì).機體正常時，腦內(nèi)多巴胺和5-羥色胺的含量保持相對平衡，機體的活動正常運行.機體進行長時間運動時，支鏈氨基酸通過血液到達運動肌氧化供能，游離色氨和支鏈氨基酸的相對比值升高，并且腦內(nèi)游離色氨酸含量增多，其原因為游離色氨酸透過血腦屏障而進入腦內(nèi).長時間運動時糖元、蛋白質(zhì)功能不足，甘油和脂肪酸氧化供能增加，為肌肉收縮供能.但由于脂肪酸不溶于，水故其運輸過程中必須與血漿白蛋白結(jié)合，因而游離脂肪酸會與游離色氨酸競爭白蛋白上的結(jié)合位點.由于色氨酸與白蛋白結(jié)合較為松散，易于解離，在競爭中處于劣勢，因而血液中游離色氨酸含量升高，通過血液運輸進入腦內(nèi).腦內(nèi)增加的游離色氨酸通過色氨酸羥化酶和5-羥色氨脫竣酶兩種酶的作用合成5-羥色胺.5-羥色胺大量增加致使多巴胺和5-羥色胺比例失調(diào)，機體運動能力下降，疲勞產(chǎn)生[75].

機理四：內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)學(xué)說.此學(xué)說認為，機體在大強度的運動下代謝活動明顯增強，致使血液pH值降低，血漿滲透壓及電解質(zhì)濃度等發(fā)生變化，導(dǎo)致機體的內(nèi)環(huán)境改變，進而導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生[76].

機理五：自由基學(xué)說.如圖1，機體在進行高強度、劇烈或者衰竭運動后，機體自由基的代謝增強，有學(xué)者認為，活性氧自由基會與膜性結(jié)構(gòu)發(fā)生過氧化反應(yīng)，生成脂質(zhì)過氧化物，將會破壞膜結(jié)構(gòu)，影響膜的正常功能，并且有可能誘發(fā)血紅蛋白尿、血清酶和肌蛋白升高，運動性貧血、延遲性肌肉酸痛、肌肉疲勞等病理性改變.因此，運動后產(chǎn)生的大量自由基可能是機體疲勞的重要原因[77].Fu et al[78]也認為運動后產(chǎn)生的大量活性氧自由基與機體運動能力降低、肌肉疲勞和肌肉損傷密切相關(guān).

機理六：突變學(xué)說.突變理論認為運動疲勞不是單一因素下作用的結(jié)果而是各種因素相互作用的結(jié)果.突變學(xué)說認為運動疲勞產(chǎn)生的原因主要是興奮性降低、肌力下降、能源物質(zhì)消耗三維空間的平衡受到了破壞.單單一個因素如能源耗竭或肌力下降等導(dǎo)致肌肉僵直的情況是不會出現(xiàn)的.機體能源物質(zhì)消耗過程以及神經(jīng)或肌肉的興奮性過程中存在一個突變點，此突變點主要表現(xiàn)為興奮性的急劇下降或者輸出功率的驟然崩潰，進而導(dǎo)致運動性疲勞的發(fā)生.突變理論認為機體內(nèi)運動性疲勞的控制鏈的每一部分都至關(guān)重要，任何部分被破壞都會影響骨骼肌的收縮，進而導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生[79].

圖1 自由基的作用機理Fig.1 The mechanism of free radical

6.2 抗疲勞肽的作用機制

抗疲勞肽具有一系列優(yōu)點，例如維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、調(diào)節(jié)機體器官的功能、促進機體代謝、提高機體工作能力.另外，運動員補充適量水解蛋白肽，可增加其體重(特別是瘦弱者)，增強其肌肉力量，提高其血清總鈣含量，延緩或者抑制因為運動疲勞而引起的機體內(nèi)的“負氮平衡”產(chǎn)生的副作用，保持或者促進機體內(nèi)蛋白質(zhì)的正常合成，降低或者減輕因運動而引起的各種生理變化，進而達到抗疲勞的作用.抗疲勞肽的作用機理可能是以下幾個方面.

機理一：抗疲勞肽能夠提高疲勞機體的糖元含量.機體進行長時間、過量的運動將會大量消耗體內(nèi)糖元物質(zhì)，機體產(chǎn)生疲勞感.抗疲勞肽能夠提高疲勞機體的糖元含量，提高機體的運動機能，延緩機體的疲勞[80].劉娜等[81]對大豆寡肽進行抗疲勞作用研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆寡肽能夠延長小鼠力竭游泳時間，提高肌糖原和肝糖原含量，進而起到一定的抗疲勞作用.張鐵華等[82]通過復(fù)合酶可控水解玉米蛋白粉制得高F值寡肽，并研究高F值寡肽的抗疲勞，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，高、中劑量組灌胃小鼠游泳后肝糖原含量分別為對照組的3.2和2.3倍，起到一定的抗疲勞作用.Sun et al[83]以蛋清蛋白粉為原料，通過胃蛋白酶酶解制得蛋清肽，并進行抗疲勞性研究，發(fā)現(xiàn)其能提高小鼠運動后的肝糖原和肌糖原含量，具有一定的抗疲勞活性.

機理二：抗疲勞肽能夠消除疲勞物質(zhì)蓄積.運動疲勞會造成血乳酸、血尿素氮等疲勞物質(zhì)堆積，抗疲勞肽能夠抑制乳酸、血清尿素氮等物質(zhì)在運動機體內(nèi)的含量，緩解機體的疲勞[84].尹曉平等[85]通過酶解天山馬鹿血制備抗疲勞肽并對其進行抗疲勞研究，定期灌胃小鼠天山馬鹿血多肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其定期灌胃的試驗組小鼠運動后血尿素氮和血乳酸含量水平均低于對照組.徐愷等[86]通過對小鼠定期灌胃南極磷蝦脫脂蛋白肽以研究其對小鼠抗疲勞的影響，發(fā)現(xiàn)高劑量組小鼠負重游泳時間均明顯高于空白組，血清中血乳酸、血尿素氮含量明顯低于空白組.

機理三：抗疲勞肽具有清除自由基的作用.機體新陳代謝過程中會產(chǎn)生一類不僅具有非?；钴S的化學(xué)性質(zhì)與高度氧化活性，而且?guī)в?個或幾個不配對電子的基團或者原子，該原子或基團稱為自由基.如圖2所示，自由基具有十分活躍的化學(xué)性質(zhì)，為了重歸穩(wěn)態(tài)，自由基會搶奪其他分子的電子來配對.而抗氧化劑可以通過貢獻自己的電子來中和自由基，抑制自由基的連鎖反應(yīng)[87].自由基主要包括以下幾種：羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基()、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1O2).機體內(nèi)適量的自由基是維持生命活動所必需的，但過量的自由基會與機體內(nèi)的其他化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，對機體產(chǎn)生一定的損害，導(dǎo)致心腦血管疾病、退行性疾病和組織損傷炎癥等各種疾病.故而，氧自由基被認為與機體運動能力降低、肌肉疲勞、肌肉損傷等有密切聯(lián)系.有學(xué)者認為機體補充抗氧化劑能夠減緩氧化損傷并且有利于改善機體的免疫功能.抗氧化肽發(fā)揮作用的主要原理是自由基清除效力、金屬離子螯合作用和猝滅單線態(tài)氧.近些年，許多醫(yī)學(xué)研究表明，運動后機體產(chǎn)生大量自由基，會破壞組織和細胞的生物膜使其通透性發(fā)生變化，引發(fā)生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成蛋白質(zhì)變性和線粒體功能障礙等，導(dǎo)致Ca2＋在胞漿中蓄積，細胞代謝受到阻礙，線粒體呼吸鏈受到了破壞，肌肉收縮能力下降，從而使機體處于疲勞狀態(tài).因此，自由基的蓄積是引起疲勞產(chǎn)生的重要原因.機體在運動缺氧狀態(tài)下，各個組織器官會自我調(diào)節(jié)為機體供能，促進代謝產(chǎn)物的清除，促進機體自由基的清除，提高機體耐受力.機體運動到力竭時，自由基的生成量是正常水平的2～3倍，自由基的清除速率小于生成速率，使得機體抗氧化體系失去了平衡，脂質(zhì)過氧化物水平升高，造成一系列的生化指標變化，例如酶失活、蛋白質(zhì)變性、細胞生物膜功能降低、離子運轉(zhuǎn)紊亂等，導(dǎo)致機體運動能力下降.正常情況下機體自由基產(chǎn)生與清除體系保持平衡，當機體進行高強度、過負荷的運動之后，機體內(nèi)這一平衡被打破，生物膜的不飽和脂肪酸受到大量自由基的攻擊使其通透性受到破壞，產(chǎn)生了細胞內(nèi)酶外釋、紅細胞裂解、細胞離子轉(zhuǎn)運紊亂、線粒體功能失調(diào)、氧代謝能力減弱、ATP生成減少及能量供應(yīng)不足等影響，致使機體的運動能力下降，進而導(dǎo)致產(chǎn)生疲勞[88].顧芳等[89]對乳源免疫調(diào)節(jié)肽進行抗疲勞肽研究時發(fā)現(xiàn)乳源免疫調(diào)節(jié)肽能夠提高小鼠運動后的自由基清除能力.肖露平[90]研究表明，在相同的運動強度下，灌喂大豆肽組的小鼠的自由基清除活力顯著高于生理鹽水組.

圖2 抗疲勞肽的作用機理Fig.2 The mechanism of anti-fatigue peptide

目前有多種生物活性肽被證實具有抗氧化活性的同時，還具備了抗疲勞的效果.王茵等[91]在研究天然蝦青素的抗氧化和抗疲勞活性時發(fā)現(xiàn)天然蝦青素的抗氧化和抗疲勞能力的關(guān)系呈正相關(guān)，二者相輔相成.陳圓圓等[92]研究發(fā)現(xiàn)天然蝦青素不僅能夠為機體提供能量，也能夠減少肌肉乳酸的生成，減少肌肉損傷，而且能夠促進自由基的清除，提高超氧化物歧化酶活力，提高機體的抗氧化能力，并且抗氧化與抗疲勞之間存在著顯著的相關(guān)性，通過補充抗氧化劑也能延緩機體疲勞，提高運動能力.申彩虹[93]以海參干制品為原料制備海參寡肽與海參多肽，通過體外抗氧化試驗與體內(nèi)抗疲勞動物試驗對比兩者的生物活性差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海參肽具有顯著的抗氧化活性及抗疲勞活性，海參寡肽抗氧化活性及抗疲勞活性顯著優(yōu)于海參多肽，并且發(fā)現(xiàn)其抗疲勞活性與分子量分布有一定聯(lián)系.

此外，在一些非肽類活性物質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)抗氧化與抗疲勞活性存在一定的關(guān)聯(lián)性.陳飛等[94]研究發(fā)現(xiàn)筋骨草可以延長小鼠負重游泳時間，降低運動后小鼠血尿素氮含量，提高肝糖原和肌糖原的儲備量，降低血清丙二醛水平，提高超氧化物歧化酶活性，具有較強的抗疲勞和抗氧化活性.陳慧嬋[95]通過連續(xù)4周對小鼠灌胃一定質(zhì)量濃度梯度的香菇全粉溶液，發(fā)現(xiàn)香菇全粉溶液能夠延緩疲勞的發(fā)生，促進疲勞消除，提高小鼠的運動耐力，具有良好的抗疲勞作用，并且可以提高機體的總抗氧化能力，提高機體超氧化物歧化酶等多種抗氧化酶活性，促進機體分解有害物質(zhì)，促進機體清除運動后產(chǎn)生大量的自由基，減緩自由基對機體的損害，具有良好的體內(nèi)抗氧化作用.李明[96]研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草多糖能顯著延長小鼠的力竭游泳時間，提高肝糖原和肌糖原儲備量，抑制丙二醛的累積，增加血清SOD活性，并且通過一系列體外試驗研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草多糖能夠清除氧自由基和羥自由基，因而白花蛇舌草多糖不僅具有體外抗氧化活性，還具有良好的抗疲勞活性.

7 抗疲勞肽研究現(xiàn)狀與展望

疲勞是機體運動一段時間后運動機能下降、不能保持原有運動水平的癥狀，已經(jīng)成為影響人體健康、工作效率的嚴重問題[97].隨著社會的發(fā)展、生活節(jié)奏的加快，因工作需要而造成的飲食不規(guī)律、睡眠不足等問題持續(xù)困擾著人們，最終導(dǎo)致人們的身體持續(xù)處在亞健康狀態(tài).人們越來越重視對具有抗疲勞、提高免疫力等功效的功能性食品的研究，而抗疲勞肽是一種良好的生物活性肽，在吸收速率、生物學(xué)功能方面具有很大的開發(fā)潛力.目前，抗疲勞肽的研究主要集中于抗疲勞肽的提取、分離及其產(chǎn)品研發(fā)，對抗疲勞肽量效關(guān)系和構(gòu)效關(guān)系的研究尚不夠深入，還有許多未知領(lǐng)域等待發(fā)掘.Hayakawa et al[98]研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)炎癥可能是疲勞的一大誘因.近年來對于腦內(nèi)疲勞的研究還知之甚少，復(fù)雜的神經(jīng)通路與疲勞的關(guān)系還有待研究.在抗疲勞肽的評價方面，目前普遍通過小鼠試驗，測定小鼠血液指標來評價其抗疲勞的功效，但小鼠模型還缺乏統(tǒng)一的標準以及疲勞模型，不同的造模會造成抗疲勞功能性評價尺度不一致，制約著抗疲勞肽研究的進一步發(fā)展.我國抗疲勞肽相關(guān)研究與發(fā)達國家還有一定差距，在國內(nèi)的認可度也不高，但正因此給了我國抗疲勞肽產(chǎn)品廣闊的發(fā)展空間.在以后的研究中，應(yīng)該尋找出某種更能準確反映抗疲勞肽與機體關(guān)系的疲勞模型，并且加深抗疲勞肽的量效關(guān)系和構(gòu)效關(guān)系的研究，以促進抗疲勞肽的深入研究.

現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究認為，生物活性肽易被機體消化吸收，當體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)被過量消耗時，會導(dǎo)致機體內(nèi)環(huán)境失調(diào)，各系統(tǒng)功能紊亂、低效.當機體處于疲勞狀態(tài)時，攝入生物活性肽將會有效地補充活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，使細胞代謝得到改善，失調(diào)的內(nèi)環(huán)境得以恢復(fù)，使身體的各系統(tǒng)、各器官正常地工作，進而達到延緩或消除疲勞的目的.故而，抗疲勞肽作為一種功能性食品的重要基料，受到了從事體力、腦力、體育運動等的人群的青睞[99].目前行業(yè)對于抗疲勞肽的研究正在不斷加深，已有學(xué)者從牛乳、靈芝、人參、牡蠣等動植物中提取出具有抗疲勞活性的生物活性肽，但對于具有抗疲勞活性的生物活性肽的開發(fā)和應(yīng)用還比較匱乏.肖笑潔[100]將阿片肽應(yīng)用于奶粉中制成了富含阿片肽奶粉，通過試驗證實了富含阿片肽奶粉能夠改善睡眠，有抗疲勞的作用.李存孝[101]以大豆蛋白為原料，靈芝為菌種，進行液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)肽飲料，通過肽飲料的抗疲勞生理活性試驗表明，該肽飲料具有明顯的抗疲勞活性.馬曉偉等[102]用人參總皂苷提取物、肌醇、精氨酸、牛磺酸、濃縮果汁等物質(zhì)制成參肽氨基酸飲料，研究發(fā)現(xiàn)該飲料可以提高小鼠運動后的肝糖原含量，降低血乳酸含量，具有良好的抗疲勞作用.郭麗等[103]以新鮮牛奶、黑米和大豆β-伴球蛋白肽為原料，通過一系列加工過程研發(fā)出一種具有抗疲勞功效的保健型酸乳.雷海容等[104]以大豆低聚肽和低脂奶粉等原料制備出了一種富肽奶粉，并且由小鼠負重游泳試驗可知，服用不同劑量的富肽奶粉試驗組均能延長小鼠的負重游泳時間，其中劑量為6 g·d-1的試驗組小鼠平均游泳時間高于2 g·d-1組，并且比對照組延長了3.3 min，表明富肽奶粉具有一定的延緩疲勞、延長運動時間的作用.但是，抗疲勞肽應(yīng)用的食品的種類仍十分有限，目前食品行業(yè)仍需對此進行研究，更好地將其應(yīng)用于食品中.

隨著社會的發(fā)展，抗疲勞肽的研究和應(yīng)用越來越受到了各界的關(guān)注，抗疲勞肽的作用機制、構(gòu)象及功能評價的深入研究將會對新的抗疲勞肽的探索與確定產(chǎn)生較大幫助.抗疲勞肽在吸收速度及生物學(xué)功能方面都具有獨特的優(yōu)勢.未來，抗疲勞肽將會引領(lǐng)抗疲勞功能性食品的潮流，并成為食品行業(yè)研究的新熱點，同時成為氨基酸藥物以及保健食品研發(fā)的新趨向.