新生大鼠哺乳期間斷吸入七氟烷對(duì)老年期行為學(xué)及海馬ApoE的影響*

吳振宇，謝 笛，唐春春，朱宇航，朱昭瓊△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州遵義 563000；2.貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000；3.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院ICU，貴州遵義 563000)

嬰幼兒時(shí)期是大腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，該時(shí)期機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)于內(nèi)外環(huán)境的變化異常敏感[1]。小兒智力發(fā)育狀況直接關(guān)系其未來成長(zhǎng)的遠(yuǎn)期結(jié)果，但由于疾病、創(chuàng)傷、意外等多重風(fēng)險(xiǎn)因素的存在，不同年齡的小兒可能面臨需要在全身麻醉下進(jìn)行一次或多次的醫(yī)學(xué)檢查及治療。目前已有研究表明老年患者接受七氟烷麻醉后可出現(xiàn)顯著持久的認(rèn)知功能障礙[2]。但臨床常用小兒全身麻醉藥七氟烷麻醉后，對(duì)嬰幼兒時(shí)期大腦發(fā)育及遠(yuǎn)期的認(rèn)知功能的影響目前鮮有報(bào)道。載脂蛋白E(apolipoprotein-E，ApoE)及其基因型的異常表達(dá)是目前較為公認(rèn)的影響老年期認(rèn)知功能的重要因素[3]，然而對(duì)其他年齡段影響不明。故本實(shí)驗(yàn)觀察哺乳期大鼠間斷吸入七氟烷麻醉后，哺乳期、老年期行為學(xué)變化及海馬ApoE變化差異，探討間斷吸入七氟烷麻醉影響大鼠海馬ApoE變化與不同時(shí)期認(rèn)知功能的改變，并探索其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要藥品、試劑與儀器 七氟烷(批號(hào)：65130704，山東魯南貝特制藥有限公司)；ApoE一抗(北京奧博森生物技術(shù)有限公司)；GTVision Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(上?；蚩萍加邢薰?；Trizol、PrimeScript RTReagent Kit(TaKaRa公司，日本)；iQ SYBR GreenSupermix(Bio-Rad公司，美國(guó))；Fabius麻醉機(jī)、Va-mos氣體監(jiān)測(cè)儀(Draeger公司，德國(guó))；自制吸入麻醉箱；Morris水迷宮測(cè)試儀(成都泰盟科技有限公司)；顯微鏡(Olympus公司，日本)；CFX熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2動(dòng)物選擇及分組 新生7日齡SD大鼠48只，雌雄不拘，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(渝)2012-0005]。依照體質(zhì)量及大鼠年齡采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即間斷七氟烷麻醉哺乳期(P0～P37)組(Sev1組，n=12)、哺乳期對(duì)照組(Con1組，n=12)、間斷七氟烷麻醉老年期(P600～P606)組(Sev2組，n=12)及老年期對(duì)照組(Con2組，n=12)。Sev1、2組分別于出生后第7天(P7)、第14天(P14)、第21天(P21)經(jīng)七氟烷處理：將自制吸入麻醉箱(75 cm×40 cm×15 cm)進(jìn)、出氣口連接麻醉機(jī)及氣體監(jiān)護(hù)儀，調(diào)節(jié)氣體流量及七氟烷揮發(fā)罐完成箱內(nèi)氣體平衡，待進(jìn)出氣口七氟烷濃度穩(wěn)定于2.6%后放入大鼠，并維持2.6%七氟烷濃度麻醉2 h；Con組在上述時(shí)間點(diǎn)分別吸入空氧混合氣體(空氣1 L/min+ O21 L/min)2 h。麻醉結(jié)束待自然蘇醒后放回原飼養(yǎng)籠喂養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)濕度50%～60%，溫度20～24 ℃，自然晝夜循環(huán)光照，母乳喂養(yǎng)。

1.3認(rèn)知功能測(cè)定 Sev1組、Con1組于第31～37天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括l d的適應(yīng)性訓(xùn)練、5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)和1 d的空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：每天4次，將平臺(tái)設(shè)置為低于水面1.5 cm。依次從4個(gè)象限的盆壁中點(diǎn)將大鼠面向盆壁放入水中，以大鼠120 s內(nèi)找到并爬上平臺(tái)時(shí)間記錄為逃避潛伏期。若120 s內(nèi)沒有找到平臺(tái)，則指引其找到并置于平臺(tái)上休息20 s后再次實(shí)驗(yàn)。若大鼠3次均未能爬上平臺(tái)，將予以剔除?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6天，撤去平臺(tái)，大鼠從原平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)象限入水，游泳120 s，記錄原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比，原平臺(tái)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比，原平臺(tái)象限進(jìn)入次數(shù)百分比。Sev2組(n=12)、Con2組(n=12)于20個(gè)月完成上述相同實(shí)驗(yàn)。

1.4海馬ApoE mRNA表達(dá)的檢測(cè) 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即取材，每組各6只腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后取海馬組織，置于0.5 mL Trizol液中，用研杵充分勻漿至組織完全裂解，加入氯仿0.2 mL，快速搖勻，4 ℃以12 000 r/min離心10 min，取出上清液，加0.2 mL異丙醇搖勻后，室溫靜置10 min，4 ℃以12 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入75%乙醇0.5 mL，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，棄上清液。將EP管倒置于濾紙上室溫下自然干燥，以去酶水50 μL溶解。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(A260/A280)。根據(jù)GenBank中目的基因全序列，使用Primer Premier5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，ApoE mRNA上游引物：5′-GTG CAG ACG CTT TCT GAC C-3′,下游引物：5′-CTT CCG TCA TAG TGT CCT CCA TC-3′。熒光定量PCR反應(yīng)體系為ddH2O 7.6 μL,SYBR 10 μL,上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DNA模板1.6 μL，每管共計(jì)20 μL。PCR反應(yīng)條件：95.0 ℃預(yù)變性10 s；95.0 ℃ 5 s，60.6 ℃ 20 s，循環(huán)40次；55.0 ℃開始，每0.5 ℃采集10 s熒光。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5海馬ApoE、ApoE4表達(dá)的檢測(cè) 水迷宮結(jié)束后立即取材，將兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每組各6只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后處死，取出腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后石蠟包埋切片、脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加一抗。次日復(fù)溫，PBS沖洗3次后孵育二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。400倍光鏡下進(jìn)行半定量分析，每張切片選取海馬CAl區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)，每區(qū)選取4個(gè)視野，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件檢測(cè)144個(gè)(1蛋白×12標(biāo)本×3區(qū)×4視野=144)視野A值，以平均A值反映ApoE、ApoE4的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1定位航行實(shí)驗(yàn) 隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加，各組大鼠逃避潛伏期呈縮短趨勢(shì)，其中Sev1組與Con1組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)第3天Sev2組大鼠與Con2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 哺乳期組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較

2.1.2空間探索實(shí)驗(yàn) Sev1組與Con1組相比較，Sev2組與Con2組相比較，原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比、原平臺(tái)象限運(yùn)動(dòng)距離百分比、原平臺(tái)象限進(jìn)入次數(shù)百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2熒光定量PCR結(jié)果 Sev1組與Con1組比較，Sev2組與Con2組比較，大鼠海馬ApoE mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)。見表2。

2.3免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1大鼠海馬ApoE蛋白表達(dá)結(jié)果 與Con1組比較，Sev1組海馬CAl區(qū)和CA3區(qū)ApoE表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，DG區(qū)ApoE表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Con2組比較，Sev2組大鼠海馬各分區(qū)ApoE蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

a：P<0.05，與Con2組比較

圖2 老年期組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較

表2 海馬ApoE表達(dá)水平比較

a：P<0.05，與Con1組比較；b：P<0.05，與Con2組比較

2.3.2大鼠海馬ApoE4蛋白表達(dá)比較結(jié)果 Sev1組與Con1組比較，Sev2組與Con2組比較，大鼠海馬各分區(qū)ApoE4蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別CA1區(qū)CA3區(qū)DG區(qū)Sev1組0.197±0.0310.202±0.0180.192±0.026Con1組0.198±0.0210.203±0.0270.152±0.016Sev2組0.124±0.0360.134±0.4220.152±0.072Con2組0.115±0.0150.142±0.0470.132±0.048

3 討 論

全身麻醉與認(rèn)知功能變化的研究一直是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)話題。七氟烷因其藥理特性的優(yōu)勢(shì)，已成為小兒全身麻醉藥的常用藥物之一。小兒由于語言表達(dá)能力、客觀事物反應(yīng)能力的受限性，圍術(shù)期通常難以配合醫(yī)務(wù)人員或?qū)W者的觀察，所以目前的臨床研究中罕有小兒經(jīng)麻醉后出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的報(bào)道。然而患兒家長(zhǎng)及學(xué)者們依然擔(dān)心全身麻醉會(huì)對(duì)小兒未來的認(rèn)知能力產(chǎn)生影響。目前臨床應(yīng)用于嬰幼兒的七氟烷濃度為2.6%左右[4]，且七氟烷的臨床99%有效濃度為1.3 MAC，通過換算，濃度也為2.6%。而新生期大鼠七氟烷最低肺泡有效濃度(minimum alveolar concentration，MAC)值約2.0%[5]。故參考文獻(xiàn)[6]，本研究于新生大鼠7、14、21 d間斷重復(fù)吸入2.6%七氟烷麻醉建立動(dòng)物模型，以模擬臨床上接受七氟烷麻醉患兒，觀察近期及遠(yuǎn)期行為學(xué)相關(guān)的變化，并探討其可能機(jī)制。

目前用于檢測(cè)認(rèn)知功能經(jīng)典的行為學(xué)方法是Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[7]，本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)哺乳期及老年期大鼠認(rèn)知功能。本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)先天愚型大鼠。定位航行試驗(yàn)檢測(cè)大鼠陳述性記憶能力，陳述性記憶屬于外顯記憶，海馬和內(nèi)側(cè)顳葉是其核心腦區(qū)[8]。由Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)，其與逃避潛伏期呈負(fù)相關(guān)[9]，即陳述性記憶能力強(qiáng)，則逃避潛伏期短。逃避潛伏期延長(zhǎng)，反映大鼠陳述性記憶能力受到損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，哺乳期大鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練時(shí)間增加呈縮短趨勢(shì)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。老年期大鼠逃避潛伏期隨時(shí)間增加呈縮短趨勢(shì)，定位航行實(shí)驗(yàn)第3天Sev2組逃避潛伏期相對(duì)Con2組時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)，但隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，兩組大鼠逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？臻g探索實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)空間聯(lián)想和回憶能力[10]，是對(duì)之前定位航行實(shí)驗(yàn)中記憶信息的再提取。本研究發(fā)現(xiàn)，哺乳期大鼠、老年期大鼠原平臺(tái)滯留時(shí)間百分比、原平臺(tái)運(yùn)動(dòng)距離百分比、原平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明吸入2.6%七氟烷麻醉對(duì)核心腦區(qū)的記憶輸出功能并不造成影響。本研究行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，新生期大鼠間斷七氟烷麻醉對(duì)其老年期陳述性記憶可能存在影響，但這種影響隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加是可逆的，對(duì)大鼠的記憶提取能力沒有影響。

目前，國(guó)內(nèi)外均有研究表明ApoE及其基因型是發(fā)生認(rèn)知功能障礙的易感基因，也是引起阿爾茨海默病(AD)的危險(xiǎn)因素，其與認(rèn)知功能障礙的慢性演化甚至進(jìn)展為AD密切相關(guān)[11-12]。ApoE分為3種亞型，分別為ApoE2、ApoE3及ApoE4。有研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ApoE作為膽固醇載體運(yùn)輸?shù)闹|(zhì)對(duì)軸突生長(zhǎng)有重要作用，ApoE4可降低腦中脂質(zhì)代謝水平并導(dǎo)致脂質(zhì)異常，從而促進(jìn)認(rèn)知障礙的發(fā)生[13]。HANSON等[14]研究也指出，ApoE與Aβ的清除代謝密切相關(guān)，Aβ是大腦“老年斑”形成的重要誘因，ApoE可通過分子伴侶的形式與Aβ結(jié)合，影響星形細(xì)胞和神經(jīng)元對(duì)Aβ的清除，導(dǎo)致老年斑形成和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而引起認(rèn)知功能障礙，且Apo4攜帶者清除能力弱于Apo3，故Apo4更易引起Aβ的沉積，使海馬/腦內(nèi)的“老年斑”沉積增加，進(jìn)而促進(jìn)認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。本研究中發(fā)現(xiàn)，間斷吸入2.6%七氟烷后，哺乳期、老年期海馬ApoE mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)。ApoE mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，在ApoE的生成過程中有重要作用，故ApoE mRNA表達(dá)量的增高可能提示局部組織蛋白質(zhì)的變化。進(jìn)一步對(duì)比各組大鼠海馬各分區(qū)ApoE蛋白表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，Sev1組大鼠CA1區(qū)、CA3區(qū)ApoE蛋白表達(dá)水平較Con1組明顯上調(diào)(P<0.05)。海馬CA1區(qū)是學(xué)習(xí)記憶信號(hào)在海馬的主要輸出區(qū)域[15]。CA3區(qū)是聯(lián)想記憶產(chǎn)生的重要腦區(qū)，分為自聯(lián)想和異聯(lián)想記憶[16]。而Sev2組大鼠海馬各分區(qū)ApoE蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再進(jìn)一步分析大鼠海馬各分區(qū)ApoE4蛋白表達(dá)比較分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，間斷吸入七氟烷后，短期內(nèi)可以導(dǎo)致大鼠海馬ApoE上調(diào)，提示間斷吸入七氟烷有產(chǎn)生一過性神經(jīng)毒性及認(rèn)知功能障礙的可能性，但隨著時(shí)間的增加，這種神經(jīng)毒性可以通過某種途徑自行被消除。分析其原因可能與ApoE基因多態(tài)的功能特異性有關(guān)，本課題組前期研究表明ApoE2等位基因與AD的危險(xiǎn)性下降有關(guān)[17]。也有研究指出ApoE3可增加Tua蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)等[18]。故推測(cè)哺乳期大鼠接受間斷七氟烷麻醉后，其可能存在ApoE2、ApoE3表達(dá)的升高，可能與認(rèn)知功能障礙的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)。這種ApoE多態(tài)性基因的相互作用也可能與七氟烷暴露時(shí)間及濃度存在相關(guān)性。且本實(shí)驗(yàn)中哺乳期及老年期大鼠ApoE4檢測(cè)未見異常表達(dá)，可以認(rèn)為不必?fù)?dān)心有與此機(jī)制相關(guān)的認(rèn)知障礙發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中哺乳期大鼠間斷2.6%七氟烷麻醉雖然在大鼠幼年期引起了海馬ApoE改變，但未造成老年期大鼠海馬ApoE異常及明顯行為學(xué)改變，提示該濃度七氟烷麻醉對(duì)發(fā)育中大鼠大腦的影響是短暫性的，并不影響遠(yuǎn)期行為學(xué)。文獻(xiàn)[19]的觀點(diǎn)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這也符合朱霞等[20]認(rèn)為七氟烷影響認(rèn)知功能的效應(yīng)是短期的、一過性的推測(cè)。

綜上所述，哺乳期大鼠間斷2.6%七氟烷麻醉后，可對(duì)大鼠海馬ApoE產(chǎn)生短暫影響，但并不足以造成大鼠老年期海馬ApoE異常及明顯的行為學(xué)改變，可為臨床使用該濃度七氟烷提供參考。同時(shí)本研究也存在一定不足之處，筆者將進(jìn)一步探究新生期及老年期大鼠吸入七氟烷后海馬ApoE多態(tài)性的變化，以及對(duì)其他認(rèn)知功能相關(guān)基因及蛋白進(jìn)行進(jìn)一步定性、定量分析，更深層次地探討七氟烷吸入麻醉與認(rèn)知功能改變的相關(guān)機(jī)制。