miRNA-32啟動(dòng)子區(qū)域相互作用蛋白的分析*

吳巍蕓

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,廣東湛江 524001)

大腸癌是消化系統(tǒng)主要的惡性腫瘤之一。微RNA(miRNA)是一類長18～25 nt 的非編碼小分子RNA，廣泛參與了生物體多種生理病理過程，如個(gè)體發(fā)育，細(xì)胞增殖、凋亡和分化，代謝與應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，腫瘤形成等，在疾病的診斷、治療、預(yù)測(cè)預(yù)后及藥物療效方面均具有巨大的潛力[1-2]。作者前期研究顯示，miRNA-32 在大腸癌組織表達(dá)較正常組織顯著上調(diào)，且與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)；生存曲線分析顯示，miRNA-32表達(dá)增高的患者預(yù)后較 miRNA-32 表達(dá)不增高的患者差[3-4]。體外研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-32 過表達(dá)可以通過抑制靶基因第 10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome ten,PTEN)增強(qiáng)大腸癌細(xì)胞的增殖，減少凋亡，促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲等，參與大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程[3-4]。但miRNA-32在大腸癌中的上調(diào)機(jī)制尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)通過DNA pulldown 技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的方法對(duì) miRNA-32啟動(dòng)子區(qū)域相互作用蛋白進(jìn)行分析，進(jìn)一步用生物信息學(xué)方法對(duì)相互作用蛋白進(jìn)行 GO富集分析及 KEGG 通路分析，旨在揭示可能與miRNA-32啟動(dòng)子存在相互作用的蛋白，以期為進(jìn)一步研究miRNA-32表達(dá)調(diào)控的機(jī)制提供重要的信息。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人大腸癌細(xì)胞株HCT-116購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑 高純度質(zhì)粒小體中量試劑盒、Universal DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；高保真Prime STAR DNA聚合酶試劑盒、DNA標(biāo)記物購自Takara公司；快速銀染試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Dynabeads?M-280鏈霉親和素購自Thermo公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1DNA pulldown 蛋白結(jié)合探針制備 PCR擴(kuò)增miRNA-32所在的宿主基因TMEm245轉(zhuǎn)錄起始上游-1 987～-1 bp片段。上游引物：5′-CAG CCT GTT CAA CAT GGT GAA-3′，下游引物：5′- GTA ATG GGA GTC GGG CTA GAA AC -3′ 。并在上游引物 5′用生物素標(biāo)記。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；循環(huán)參數(shù)分別為94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增情況。Universal DNA 純化回收試劑盒純化、回收擴(kuò)增的目的片段并測(cè)序鑒定。

1.2.2DNA pulldown實(shí)驗(yàn) HCT-116細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白。m280鏈霉素親和磁珠與上述生物素標(biāo)記的DNA探針冰上孵育4 h結(jié)合(實(shí)驗(yàn)組)，以無生物素標(biāo)記的DNA探針-磁珠為陰性對(duì)照組。再往磁珠-DNA混合物中加入細(xì)胞裂解液(約含蛋白1 mg)，4 ℃孵育過夜。清洗緩沖液清洗磁珠-DNA探針-蛋白復(fù)合物，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白條帶并銀染。

1.2.3質(zhì)譜鑒定和分析 將電泳條帶胰酶酶解成肽段，純化肽段后用質(zhì)譜儀 Thermo Scientific Q Exactive 分析。質(zhì)譜原始文件經(jīng)過MM File Conversion軟件處理轉(zhuǎn)換，得到MGF格式文件，然后用MASCOT檢索uniprot數(shù)據(jù)庫。質(zhì)譜鑒定及分析送廣州賽哲生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.4差異表達(dá)蛋白GO、KEGG富集分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組比較篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO、KEGG富集分析。GO 富集包括細(xì)胞組成(cellular component)，分子功能(molecular function)及生物學(xué)過程(biological process)三方面內(nèi)容。在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使生物學(xué)功能，基于 KEGG 通路分析有助于更進(jìn)一步了解基因生物學(xué)功能。GO富集與KEGG通路檢驗(yàn)時(shí)，當(dāng)P<0.05的GO功能條目及主要KEGG信號(hào)通路被認(rèn)為是顯著富集。

2 結(jié) 果

2.1DNA pulldown獲取miRNA-32啟動(dòng)子區(qū)域相互作用蛋白 用生物素標(biāo)記的DNA探針-磁珠復(fù)合物pulldown能與DNA 相互作用的蛋白。pulldown后的樣品進(jìn)行 SDS-PAGE分離，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比存在蛋白條帶差異(input為陽性對(duì)照組)，見圖1。

M：DNA標(biāo)記物；1：input；2：生物素標(biāo)記探針實(shí)驗(yàn)組；3：非生物素標(biāo)記探針組(陰性對(duì)照組)

圖1DNApulldown實(shí)驗(yàn)

表1 質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的差異蛋白

圖2 差異蛋白的GO富集分析

2.2質(zhì)譜鑒定及分析 將實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組的電泳條帶送質(zhì)譜鑒定及分析。去除與陰性對(duì)照組重復(fù)及未能鑒定的蛋白，共篩出191個(gè)差異蛋白，部分蛋白見表1。差異蛋白認(rèn)為是能和miRNA-32啟動(dòng)子區(qū)域相互作用的特異性蛋白。

圖3 差異蛋白的KEGG通路富集分析

2.3GO富集分析 通過GO富集分析注釋各差異蛋白的分子功能和生物進(jìn)程。從分子功能上看，大部分蛋白質(zhì)為結(jié)合(binding)蛋白質(zhì)和具有酶活性的蛋白質(zhì)。結(jié)合蛋白質(zhì)包括蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、離子結(jié)合、RNA 結(jié)合蛋白質(zhì)。酶活性蛋白質(zhì)包括具有催化活性、甲基轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。從生物學(xué)過程來看，這些蛋白質(zhì)多參與核酸代謝、基因轉(zhuǎn)錄，蛋白代謝、修飾，核質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長和再生等代謝過程，見圖2。

2.4KEGG通路富集分析 KEGG 分析顯示，各差異蛋白顯著富集于氧化磷酸化、氨基酸代謝、間隙連接、細(xì)胞周期等信號(hào)通路，還參與MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。以P<0.05為篩選條件時(shí)，這些差異蛋白共涉及24個(gè)顯著富集的通路，前20位富集通路，見圖3。

3 討 論

許多研究顯示，腫瘤中異常表達(dá)的miRNAs具有類似原癌基因或抑癌基因的功能，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用[5-6]。miRNAs在不同腫瘤中具有特定的表達(dá)模式。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn) miRNAs與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。PELLATT等[7]檢測(cè)了1 894例大腸癌組織，并與人正常結(jié)腸組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其中有12種miRNA表達(dá)水平有明顯差異，包括 hsa-miRNA-663b、hsa-miRNA-4539、hsa-miRNA-17-5p等。與大腸腺瘤相比，大腸癌患者血清的miRNA-21明顯升高，且在根治性手術(shù)后水平下降，組織和血清中miRNA-21的高表達(dá)與腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、預(yù)后顯著相關(guān)，而且血清miRNA-21水平是大腸癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素[8]。miRNA-140通過下調(diào)Smad3，抑制大腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力[9]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌中miRNA-32表達(dá)上調(diào)，且與靶基因PTEN結(jié)合，抑制其表達(dá)，參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。進(jìn)一步探討miRNA-32在大腸癌中上調(diào)的機(jī)制。miRNA的正確轉(zhuǎn)錄由復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的相互作用是其重要的組成部分。外界環(huán)境的各種刺激或不同發(fā)育階段的各種信號(hào)會(huì)促使不同的轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合，激活或抑制miRNAs的轉(zhuǎn)錄。因此，確定miRNAs上游啟動(dòng)子上的相互作用的蛋白并分析其功能對(duì)研究miRNAs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要意義。JIANG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-378在人脂肪細(xì)胞中表達(dá)升高，通過熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miRNA-378的啟動(dòng)子區(qū)域在其上游-698 bp～-94 bp處，其中含有轉(zhuǎn)錄因子SREBP和C/EBP的結(jié)合位點(diǎn)，并通過EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)，初次報(bào)道了脂肪因子和細(xì)胞因子可能通過與人脂肪細(xì)胞的miRNA-378啟動(dòng)子區(qū)域的SREBP和C/EBP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)miRNA-378的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，心肌特異性表達(dá)的miRNA-1受到肌肉組織形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子SRF和MyoD的調(diào)節(jié)[11]；YIN等[12]發(fā)現(xiàn)，在卵巢顆粒細(xì)胞中，類固醇因子-1(SF-1)能與miRNA-383的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)miRNA-383的表達(dá)。miRNA-32屬于基因內(nèi)miRNA，其宿主基因?yàn)榭缒さ鞍?45(transmembrane protein 245,TMEm245)。miRNA-32位于TMEm245的第14個(gè)內(nèi)含子中。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子編碼的miRNAs與它們的宿主基因共表達(dá)[13]，且它們產(chǎn)生在內(nèi)含子剪接之前，顯示這些miRNAs和它的宿主基因mRNA來自于相同的轉(zhuǎn)錄本，所以調(diào)控這些miRNAs和它們相應(yīng)的宿主基因表達(dá)應(yīng)是相同的機(jī)制[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)在Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索TMEm245轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約2.0 kb長度的區(qū)域，采用DNA pulldown技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域相互作用蛋白進(jìn)行分析，進(jìn)一步用生物信息學(xué)方法對(duì)相互作用蛋白進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路分析。結(jié)果顯示，DNA pulldown和質(zhì)譜分析總共鑒定到191個(gè)潛在的特異性與啟動(dòng)子區(qū)域相互結(jié)合的蛋白。GO功能富集分析結(jié)果顯示，這些相互作用蛋白涉及多種生物學(xué)功能，包括參與核酸代謝、基因轉(zhuǎn)錄，蛋白代謝、修飾，核質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長和再生等代謝過程等。KEGG通路分析結(jié)果表明這些相互作用蛋白參與多條細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，包括間隙連接、細(xì)胞周期信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等重要生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。這為進(jìn)一步研究大腸癌中miRNA-32上調(diào)及大腸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制提供了重要的信息。這些信息的預(yù)測(cè)為下一步尋找有意義的調(diào)控miRNA-32表達(dá)的蛋白提供了線索，但由于生物信息學(xué)具有一定的局限性，還需進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)及功能的驗(yàn)證，這為下一步研究提供了可靠的研究策略。