EZH2對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的調(diào)控及其機(jī)制研究*

王 希，黃昌釗，高 峰，何 鵬，王銳英，高 燕

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院四肢創(chuàng)傷骨外科，廣西桂林 541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院護(hù)理學(xué)院，廣西桂林 541001)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是指存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，能分化為包括神經(jīng)元細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的一類細(xì)胞，能進(jìn)行自我更新[1]。NSCs的發(fā)現(xiàn)和移植為解決脊髓損傷等疾病后神經(jīng)元病理性減少及神經(jīng)元間靶聯(lián)中斷提供了可能[2]。干細(xì)胞移植可通過減少二次級聯(lián)細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)體內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新(即增殖)，從而補充功能受損的神經(jīng)干細(xì)胞群[3]。因此，調(diào)控和提高NSCs的增殖至關(guān)重要。Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)是PcG基因家族的基因之一，能夠調(diào)控基因的表達(dá)，EZH2被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。并且EZH2在增殖的NSCs中高度表達(dá)[5]。但EZH2基因在NSCs增殖中的作用尚不清楚。本研究通過在人神經(jīng)干細(xì)胞(hNSCs)中過表達(dá)和敲降EZH2基因的表達(dá)，來探究EZH2基因和NSCs增殖之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1材料 人神經(jīng)元干細(xì)胞購自美國Sciencell公司。細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司；引物、EZH2敲降慢病毒和過表達(dá)慢病毒及其各自對照慢病毒購自上海漢恒生物科技有限公司；CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒和EdU檢測試劑盒購自海門市碧云天公司；細(xì)胞周期及凋亡流式檢測試劑盒購自日本東仁化學(xué)公司；胰蛋白酶、雙抗、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；EZH2、Cyclin D1、c-Myc鼠源單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗購自美國Cell Signaling公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)鼠源單克隆抗體購自美國Proteintech公司；生物安全柜及細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；倒置熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；酶標(biāo)儀購自美國bio-tek EL公司；流式細(xì)胞檢測儀購自美國BD公司；凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng) 應(yīng)用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.24種神經(jīng)干細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建 4種慢病毒(過表達(dá)對照慢病毒OV-Control，過表達(dá)慢病毒OV-EZH2；shRNA對照慢病毒sh-Control，shRNA干擾慢病毒sh-EZH2)轉(zhuǎn)染前18～24 h，將貼壁細(xì)胞鋪到細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁且生長至50%左右融合度時用含有6 μg/mL polybrene的新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液。37 ℃孵育。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。72 h后，加入2 μg/mL Puromycin，每隔2天重新?lián)Q液加入藥物，持續(xù)觀察14 d左右，直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為100%(比例=GFP陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))。隨后取一部分細(xì)胞用以收取蛋白和RNA，以檢測過表達(dá)和敲降效率。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測基因表達(dá) 每孔細(xì)胞加入TRIzol 1 mL。將樣品在室溫(15～30 ℃)放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；每使用1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min；2～8 ℃，10 000×g離心15 min。樣品分為3層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%；把水相轉(zhuǎn)移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA；每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL異丙醇，室溫放置10 min；2～8 ℃，10 000×g離心10 min，移去上清液；用75%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol至少加1 mL 75%乙醇。2～8 ℃，7 500×g轉(zhuǎn)速以內(nèi)，離心5 min，棄上清液；室溫放置干燥RNA沉淀，加入25～200 μL無RNase的水,用槍頭吸打幾次,55～60 ℃放置10 min使RNA溶解，-80 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，置于-20 ℃保存。將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：SYBRGreen Mix 12.5 μL,上游引物(正向)0.5 μL，下游引物(反向)0.5 μL，雙蒸水(ddH2O) 9.5 μL，cDNA模板 2.0 μL，總體積 25.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，循環(huán)40次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s；數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。引物序列，正向：AAT CAG AGT ACA TGC GAC TGA GA；反向：GCT GTA TCC TTC GCT GTT TCC。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞的培養(yǎng)、分組及處理同上。蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用二辛酸硫酸銅(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。隨后進(jìn)行蛋白定量和變性，應(yīng)用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，120 V恒定電壓在分離膠中電泳60 min，在300 mA恒定電流下應(yīng)用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜90 min，洗膜液(TBST)洗膜3遍后，使用5%牛奶封閉非特異性結(jié)合位點，封閉結(jié)束后，于4 ℃進(jìn)行一抗(1∶1 000稀釋)中孵育過夜，TBST洗3遍之后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(1∶2 000稀釋)室溫中孵育2 h，TBST洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光劑(ECL)反應(yīng)并利用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測。

1.2.5CCK8檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，按照基因干擾陰性對照組(sh-Control)、基因干擾組(sh-EZH2)、基因過表達(dá)對照組(OV-Control)、基因過表達(dá)組(OV-EZH2)分別對細(xì)胞進(jìn)行對應(yīng)慢病毒轉(zhuǎn)染，慢病毒轉(zhuǎn)染24 h后，直接配置含10% CCK8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。37 ℃孵育0.5 h，將孵育后的上清液轉(zhuǎn)移至96孔板，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度；Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)潤洗細(xì)胞3次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48、96 h，重復(fù)上述實驗內(nèi)容，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6EdU摻入法檢測細(xì)胞增殖 用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋EdU溶液(培養(yǎng)基:試劑A=1 000∶1)，制備適量50 μmol/L的Edu培養(yǎng)基；每孔加入100 μL 50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育1 h，棄培養(yǎng)基；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次，每次5 min；每孔加入100 μL 4%多聚甲醛細(xì)胞固定液，室溫孵育30 min；每孔加入2 mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5 min后，棄甘氨酸溶液；每孔加入100 μL PBS，脫色搖床清洗5 min，棄PBS；每孔加入100 μL滲透劑(0.5% Triton X-100的PBS)脫色搖床孵育10 min；PBS清洗1次，5 min;每孔加入100 μL的1 mg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，避光、室溫、脫色搖床孵育10 min，棄染色反應(yīng)液；每孔每次加入100 μL PBS清洗1～3次；染色完成后，熒光顯微鏡拍照。

1.2.7流式檢測細(xì)胞周期和凋亡 細(xì)胞接種于6孔板，按照基因敲降陰性對照組(sh-Control)、基因敲降組(sh-EZH2)、基因過表達(dá)對照組(OV-Control)、基因過表達(dá)組(OV-EZH2)4組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，并用1 mL PBS清洗剩余細(xì)胞1次，全部加入15 mL管中。800 r/min離心5 min，去除上清液，加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再次離心棄上清液，重復(fù)2次，最后重懸細(xì)胞于0.1 mL PBS中，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。對于細(xì)胞周期檢測，按照1∶100加入碘化丙啶(PI)染液，置于垂直混合液上室溫孵育1 h。對于細(xì)胞凋亡檢測，每樣品中分別加入5 μL PI染液和5 μL磷脂結(jié)合蛋白(Annexin-V-FITC)染液，置于垂直混合液上室溫孵育30 min，1 500 r/min離心5 min，去除上清液，加1 mL PBS重懸細(xì)胞，再次800×g離心5 min，棄上清液，重復(fù)3次，最后將洗好的細(xì)胞重懸于0.2 mL PBS中。用錫箔紙包住避光，將細(xì)胞加入流式管中，在BD流式細(xì)胞儀上分析。

2 結(jié) 果

2.1過表達(dá)和敲降穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建及鑒定 4種慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs后，利用嘌呤霉素進(jìn)行藥物篩選，14 d后，細(xì)胞GFP陽性率達(dá)到100%(圖1A)。同時，實驗結(jié)果顯示，相較于OV-Control組，OV-EZH2 mRNA EZH2的表達(dá)水平上調(diào)400%以上，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B),相較于sh-Control組，sh-EZH2組EZH2 mRNA表達(dá)水平下調(diào)至30%以下，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。Western blot得到一致的實驗結(jié)果(圖1C)。

A：細(xì)胞GFP熒光顯微鏡拍照(×40)；B：EZH2基因mRNA表達(dá)水平鑒定(n=4)；C：EZH2基因蛋白表達(dá)水平鑒定；a：P<0.05，與OV-Control組比較，b：P<0.05，與sh-Control組比較

圖1EZH2基因過表達(dá)和敲降細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)構(gòu)建鑒定

A：過表達(dá)和敲降細(xì)胞EZH2基因，CCK8檢測細(xì)胞活力(n=4)； B：試劑盒檢測神經(jīng)干細(xì)胞中EdU陽性率，激光共聚焦拍照(×40)；C：神經(jīng)干細(xì)胞中EdU陽性率統(tǒng)計圖(n=4)；a：P<0.05，與OV-Control組比較，b：P<0.05，與sh-Control組比較

圖2敲降或過表達(dá)EZH2對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

2.2過表達(dá)或敲降EZH2對NSCs增殖的影響 實驗結(jié)果顯示，對比OV-Control組，OV-EZH2組24、48、72 h時細(xì)胞增殖活力上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。OV-EZH2組EdU陽性率(69.21±9.86)%高于OV-Control組(37.00±2.70)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2B、C)。相較于sh-Control組，sh-EZH2組24、48、72 h時細(xì)胞增殖活力顯著下調(diào)(P<0.05，圖2A)，且sh-EZH2組細(xì)胞EdU陽性率(16.83±5.53)%比sh-Control組(43.52±5.99)%顯著下調(diào)(P<0.05，圖2B、C)。

2.3過表EZH2或干擾EZH2表達(dá)對NSCs細(xì)胞周期的影響 實驗結(jié)果顯示，相較于基因敲降陰性對照組(sh-Control)，EZH2干擾(sh-EZH2)組細(xì)胞處于G1期細(xì)胞比例顯著上調(diào)(圖3、表1，P<0.05)，而S期和G2期細(xì)胞比例顯著降低(圖3、表1，P<0.05)。反過來，研究中利用慢病毒對EZH2基因進(jìn)行過表達(dá)，相較于對照組(OV-Control)，在NSCs中EZH2過表達(dá)后(OV-EZH2)，G1期細(xì)胞比例顯著下降(圖3、表1，P<0.05)，而S期和G2期細(xì)胞比例顯著上升(圖3、表1，P<0.05)。

2.4體外過表達(dá)EZH2或沉默EZH2表達(dá)對NSCs凋亡的影響 研究結(jié)果顯示，EZH2干擾組和EZH2過表達(dá)組與其各自對照組相比，OV-Control組凋亡率為(5.97±0.15)%，OV-EZH2組凋亡率為(5.71±0.27)%，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；sh-Control組凋亡率為(5.74±0.19)%，sh-EZH2組凋亡率為(5.41±0.31)%，且兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

表1 過表EZH2或干擾EZH2表達(dá)對神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

a：P<0.05，與OV-Control組比較；b：P<0.05，與sh-Control組比較

圖3 過表EZH2或干擾EZH2表達(dá)對NSCs細(xì)胞周期的影響

圖4 體外過表達(dá)EZH2或沉默EZH2表達(dá)對NSCs凋亡的影響

2.5在NSCs中過表達(dá)EZH2能上調(diào)CyclinD1和c-Myc蛋白表達(dá) 通過Western blot發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)EZH2基因(P<0.05)之后，Cyclin D1和c-Myc蛋白的表達(dá)水平也隨之上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

A：Western blot實驗代表圖；B：Western blot條帶灰度統(tǒng)計分析圖；a：P<0.05，與OV-Control組比較；n=4

圖5EZH2基因過表達(dá)對CyclinD1和c-Myc蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

NSCs移植是臨床上將NSCs移植到宿主體內(nèi)，使NSCs向相關(guān)病變部位聚集并增殖存活，進(jìn)而分化為神經(jīng)功能細(xì)胞，達(dá)到神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療目的的方法。近年來，NSCs研究成為治療諸如脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的熱點手段[6]。但是，胚胎性NSCs可自動發(fā)生分化，具有無限增殖能力，移植至患者體內(nèi)有致瘤的可能[7]。另外移植的環(huán)境可能與NSCs原本的生存條件不同，不利于NSCs的存活及分化[8]。因此如何控制NSCs的增殖，既能保證移植細(xì)胞的存活率和自我更新能力，又能控制其增殖速度和分化時間節(jié)點，是目前該治療手段亟待解決的問題。因而本研究采取慢病毒手段，在NSCs中穩(wěn)定過表達(dá)和敲降EZH2基因的表達(dá)，對其在NSCs增殖中的作用及其機(jī)制進(jìn)行研究，意圖尋找到調(diào)控NSCs移植中控制細(xì)胞增殖和分化的鑰匙。

EZH2作為PCR2的催化亞基，能抑制轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響到下游重要的信號通路，在染色體水平調(diào)節(jié)基因活性，在干細(xì)胞的更新與維持中發(fā)揮重要作用[9-10]。有研究觀察到，NSCs向不同方向增殖分化時，EZH2表達(dá)水平存在明顯差異[11-12]：增殖的NSCs中高度表達(dá)，在NSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化時，EZH2表達(dá)水平降低，在NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化時，EZH2表達(dá)完全停止，在NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程中，從少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化到不成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞期間，EZH2維持高水平表達(dá)[13]。在本研究中，成功過表達(dá)和干擾EZH2基因的表達(dá)之后，分別能夠促進(jìn)和抑制NSCs的增殖，影響細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的速度，而對細(xì)胞凋亡水平并未見顯著影響；因而設(shè)法調(diào)節(jié)移植NSCs中EZH2基因的表達(dá)可以起到調(diào)控NSCs增殖的作用。另外，進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)EZH2基因，能夠促進(jìn)增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和c-Myc的表達(dá)，這可能是其調(diào)控細(xì)胞增殖潛在的分子機(jī)制，而具體的信號途徑還需要進(jìn)一步的分析和研究。

本實驗結(jié)果表明，EZH2能夠在體外調(diào)控NSCs的增殖，為臨床細(xì)胞學(xué)治療脊髓損傷及相關(guān)疾病提供了實驗依據(jù)。