南極假絲酵母脂肪酶B在離子液體/超臨界流體體系中的穩(wěn)定性模擬

張靜曉，張麗雷*，劉曉潔，吳小亮，徐 璐

1湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，恩施 445000;2湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，恩施 445000

南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)具有寬泛的底物特異性、高活性、高對(duì)映選擇性、以及在水和非水環(huán)境中的穩(wěn)定性，是生物技術(shù)中非常重要的酶，在酯交換、動(dòng)力學(xué)拆分和聚合反應(yīng)中均有廣泛應(yīng)用[1,2]。目前，在離子液體(IL)和超臨界流體(SCF)組成的兩相體系中進(jìn)行CALB催化反應(yīng)是研究的熱點(diǎn)[3-5]。在此兩相體系中，IL提供催化反應(yīng)的溶劑環(huán)境，能夠提高蛋白酶的活性、穩(wěn)定性和選擇性，并且相較于其它有機(jī)溶劑更好地保護(hù)了蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)[3,6-8]；而SCF可降低IL的黏度，促進(jìn)反應(yīng)底物的運(yùn)輸，加快反應(yīng)的進(jìn)行，并可同時(shí)將反應(yīng)產(chǎn)物從IL相中萃取出來(lái)，解決了反應(yīng)之后需要使用易揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行萃取而產(chǎn)生的污染問(wèn)題[9,10]。然而，由于IL和SCF形成的兩相體系較復(fù)雜，IL和SCF的性質(zhì)以及兩相的平衡關(guān)系均會(huì)影響到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而影響其活性，因此從原子尺度揭示此兩相體系性質(zhì)對(duì)CALB結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響可為開(kāi)發(fā)高效的IL/SCF兩相溶劑體系，以及兩相體系狀態(tài)的控制提供重要參考。

分子動(dòng)力學(xué)模擬可以獲取在實(shí)驗(yàn)中難以獲得的空間和時(shí)間尺度上生物分子系統(tǒng)的行為和性質(zhì)[11,12]，是從原子尺度研究溶劑運(yùn)動(dòng)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的有效方法。為了深入理解IL/SCF溶劑體系對(duì)CALB蛋白酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，本文采用分子動(dòng)力學(xué)方法，構(gòu)建了新型離子液體三丁基十四烷基季磷十二烷基苯磺酸鹽(CYPHOS IL-201)與無(wú)極性的超臨界CO2流體形成的兩相體系和CYPHOS IL-201與具有較大極性的超臨界CHF3流體形成的兩相體系，研究CALB在這兩種兩相體系中的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，揭示這兩種溶劑環(huán)境性質(zhì)對(duì)CALB結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。

1 分子動(dòng)力學(xué)模擬方法

1.1 分子動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建

從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇CALB蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：5a71)作為CALB蛋白的模擬模型，此結(jié)構(gòu)是迄今為止分辨率最高的CALB蛋白晶體模型[13]。

構(gòu)建的典型分子動(dòng)力學(xué)初始模型如圖1所示。CALB蛋白晶體置于邊長(zhǎng)約為11nm的立方體CYPHOS IL-201離子液體相中，離子液體相模型包含880個(gè)三丁基十四烷基季磷陽(yáng)離子和880個(gè)十二烷基苯磺酸陰離子，在立方體離子液體相上下位置擴(kuò)展出5 nm的區(qū)域，并置入20 000個(gè)超臨界流體分子(CO2或者CHF3)，體系約含有20萬(wàn)個(gè)原子。模擬過(guò)程中采用周期性邊界，經(jīng)等溫等壓系綜(NPT系綜)模擬后，體系密度收縮至約為CYPHOS IL-201離子液體密度的實(shí)驗(yàn)值。

本文構(gòu)建了五種溶劑體系，包括：超臨界CO2流體(ScCO2)、超臨界CHF3流體(ScCHF3)、離子液體CYPHOS IL-201(IL)、離子液體CYPHOS IL-201/超臨界CO2兩相體系(IL/ScCO2)、以及離子液體CYPHOS IL-201/超臨界CHF3兩相體系(IL/ScCHF3)。分別對(duì)比了CALB蛋白在這五種溶劑體系中的行為和性質(zhì)。

圖1 分子動(dòng)力學(xué)模型Fig.1 The model of molecular dynamics

1.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬條件

所有模擬均在GROMACS程序包(版本2016.3)中進(jìn)行，對(duì)CALB蛋白質(zhì)采用Amber99sb-ildn力場(chǎng)，3點(diǎn)水模型。對(duì)離子液體和超臨界流體分子采用GAFF力場(chǎng)和AM1-BCC電荷。在IL/ScCHF3兩相體系中溫度為55 ℃，壓力30MPa，其他體系中溫度為65 ℃，壓力20 MPa。實(shí)驗(yàn)研究表明，CALB在此條件下催化活性較好[4]。

對(duì)構(gòu)建的五個(gè)體系分別進(jìn)行三個(gè)階段的模擬，首先采用最陡下降法將每個(gè)系統(tǒng)中的溶劑分子進(jìn)行能量極小化。第二階段，進(jìn)行限制性動(dòng)力學(xué)模擬，保持蛋白分子固定，離子液體和超臨界流體的分子自由移動(dòng)，并將體系緩慢加熱加壓至指定溫度和壓力條件，使體系密度收縮至約為CYPHOS IL-201離子液體的實(shí)驗(yàn)密度值，并達(dá)到平衡狀態(tài)。第三階段進(jìn)行平衡狀態(tài)的模擬，每個(gè)系統(tǒng)均采用0.2 fs的時(shí)間步長(zhǎng)，分別進(jìn)行20 ns的分子模擬。為了在模擬過(guò)程中保持不同組分的恒定溫度和壓力，使用V-rescale方法控制溫度，使用Parrinello-rahman方法控制壓力。對(duì)于系統(tǒng)的每個(gè)組件，應(yīng)用PME算法估計(jì)靜電相互作用。

2 結(jié)果與討論

考察了所構(gòu)建的五個(gè)體系在模擬過(guò)程中的全體系均方根偏差(RMSD)值，結(jié)果如圖2所示，從圖中可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)5ns的模擬后，五個(gè)體系均達(dá)到了平衡狀態(tài)。

圖2 體系在模擬過(guò)程中的RMSD值Fig.2 RMSD values of systems during simulation

圖3 CYPHOS IL-201/ScCO2兩相體系中的原子數(shù)密度分布Fig.3 Atom number density distributions in the CYPHOS IL-201 / ScCO2 two-phase system

為了考查所研究的體系中離子液體CYPHOS IL-201和超臨界流體(CO2、CHF3)形成兩相的行為，將5ns至20ns范圍內(nèi)，每隔0.1ns取一幀，統(tǒng)計(jì)了IL/ScCO2和IL/ScCHF3兩個(gè)體系中三丁基十四烷基季磷陽(yáng)離子、十二烷基苯磺酸陰離子、以及超臨界流體分子在以CALB蛋白中心為中心，Z軸方向上的原子數(shù)量密度分布，并取平均值，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖4 CYPHOS IL-201/ScCHF3兩相體系中的原子數(shù)密度分布Fig.4 Atom number density distributions in the CYPHOS IL-201 / ScCHF3 two-phase system

從圖3和圖4中可見(jiàn)，CALB蛋白處于離子液體相中，并且沒(méi)有向超臨界液體相移動(dòng)的趨勢(shì)。另外，離子液體CYPHOS IL-201中的三丁基十四烷基季磷陽(yáng)離子和十二烷基苯磺酸陰離子主要分布在CALB蛋白的周?chē)?，只有極少部分分布在超臨界流體相中。超臨界流體分子有少部分進(jìn)入了離子液體相中，大部分分布在離子液體的周?chē)?，與文獻(xiàn)報(bào)道離子液體和超臨界流體的行為一致[14]。此結(jié)果表明在所研究的溫度和壓力下，離子液體CYPHOS IL-201可分別與超臨界CO2流體和超臨界CHF3流體形成具有相互作用的兩相體系。

對(duì)比IL/ScCO2和IL/ScCHF3兩個(gè)溶劑體系的行為可見(jiàn)，離子液體CYPHOS IL-201和ScCO2形成的兩相界面較ScCHF3更為明顯，說(shuō)明與ScCO2相比，ScCHF3更容易進(jìn)入到CYPHOS IL-201離子液體相中，而CYPHOS IL-201也更易分布于ScCHF3流體中。由于超臨界流體可以降低離子液體的濃度和黏度，提高反應(yīng)底物在離子液體相中的運(yùn)輸能力，從而提高酶催化反應(yīng)的效果，而CHF3具有較CO2更易溶解于CYPHOS IL-201相的能力，從而通過(guò)控制溫度和壓力可能具有更好地提高酶催化反應(yīng)的能力。

蛋白質(zhì)原子位置的均方根偏差(RMSD)和時(shí)間的函數(shù)是反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)15。RMSD是通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)與其參考結(jié)構(gòu)的最小二乘法擬合得到，定義如式(1)所示。

(1)

其中，N是體系原子的總數(shù)目，ri和ri,ref是蛋白原子分別在考察結(jié)構(gòu)和參考結(jié)構(gòu)中的位置。

圖5為CALB蛋白在所考察的五個(gè)溶劑體系中運(yùn)動(dòng)軌跡的RMSD計(jì)算結(jié)果。從圖中可見(jiàn)，CALB蛋白在ScCHF3流體中非常不穩(wěn)定，RMSD值變化劇烈，這有可能是因?yàn)镃ALB蛋白在ScCHF3中產(chǎn)生了蛋白質(zhì)變性[6]。而CALB蛋白在ScCO2流體中RMSD值比較平穩(wěn)，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，表明具有較大極性的CHF3更容易與CALB蛋白發(fā)生相互作用，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以致失去催化活性。另外，CALB蛋白在IL、IL/ScCO2和IL/ScCHF3三個(gè)溶劑體系中的RMSD值在模擬過(guò)程中變化很小，最后上下波動(dòng)在0.05 nm左右，表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性。對(duì)比CALB蛋白在ScCHF3和在IL/ScCHF3兩相體系中的結(jié)果可見(jiàn)，離子液體CYPHOS IL-201起到了穩(wěn)定CALB蛋白結(jié)構(gòu)的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道CALB在IL/ScCHF3兩相體系中可表現(xiàn)出良好的催化活性的結(jié)果一致[4]。

圖5 CALB蛋白在模擬過(guò)程中的RMSD值Fig.5 RMSD values of CALB protein during simulation

蛋白質(zhì)的均方根波動(dòng)數(shù)值(RMSF)是衡量蛋白質(zhì)原子在整個(gè)軌跡中相對(duì)于平均位置波動(dòng)的程度，計(jì)算方法如式(2)所示。

(2)

對(duì)CALB蛋白的各個(gè)殘基在五個(gè)溶劑體系中的RMSF值進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果如圖6所示。從圖中可見(jiàn)，CALB在ScCHF3流體中殘基波動(dòng)較大，可能已經(jīng)發(fā)生了蛋白質(zhì)的變性，與前述RMSD的考查結(jié)果一致。CALB蛋白的RMSF值在ScCO2和IL/ScCO2兩個(gè)體系中最為穩(wěn)定，表明CO2的存在沒(méi)有增加CALB蛋白殘基的柔性。在IL體系和IL/ScCHF3體系中，CALB蛋白的部分殘基表現(xiàn)出了較大的柔性，但是柔性部位并不相同，這是由于CYPHOS IL-201和ScCHF3與CALB蛋白的殘基之間產(chǎn)生了相互作用[3,16]。另外，CALB蛋白的催化主要由蛋白中保守的Ser105-Asp187-His224三聯(lián)體負(fù)責(zé)[17]。在這四個(gè)體系中，這三個(gè)殘基均未出現(xiàn)明顯的波動(dòng)情況，這也是在這三個(gè)體系中CALB表現(xiàn)出良好的催化性能的原因[4]。

另外，對(duì)比IL/ScCO2和IL/ScCHF3兩個(gè)體系中蛋白的RMSF值發(fā)現(xiàn)，殘基140至150區(qū)域內(nèi)，IL/ScCHF3體系中蛋白的RMSF值發(fā)生較大變化，這是由于CHF3與此區(qū)域的α螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生氫鍵相互作用，破壞了維持α螺旋結(jié)構(gòu)的N-H…O氫鍵。CHF3易破壞α螺旋結(jié)構(gòu)從而破壞蛋白結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)新型離子液體對(duì)α螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行保護(hù)是提高蛋白穩(wěn)定性的可行方法。

回轉(zhuǎn)半徑(Rg)是描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)平衡構(gòu)型的重要參數(shù)，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密性的重要指標(biāo)，可用式(3)表示。

(3)

其中，mi是原子i的質(zhì)量，是原子i相對(duì)于蛋白質(zhì)質(zhì)量中心的位置。對(duì)所研究的五個(gè)體系中的CALB蛋白在模擬過(guò)程中的回轉(zhuǎn)半徑進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果如圖7所示。

圖7 CALB蛋白在模擬過(guò)程中的回轉(zhuǎn)半徑Fig.7 Radius of gyration values of CALB protein during simulation

從圖7中可見(jiàn)，由于CALB蛋白在ScCHF3溶劑體系中可能出現(xiàn)了蛋白的變性，導(dǎo)致其回轉(zhuǎn)半徑變得較大。在其他四個(gè)溶劑體系中，CALB蛋白的回轉(zhuǎn)半徑較小，并且較為接近。其中，CALB蛋白在CYPHOS IL-201離子液體中的回轉(zhuǎn)半徑最小，其結(jié)構(gòu)最為緊湊，與前述CYPHOS IL-201離子液體有保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu)作用的結(jié)論一致。在ScCO2體系里，CALB蛋白回轉(zhuǎn)半徑有所增大，但并不明顯，然而這也有可能會(huì)導(dǎo)致蛋白酶催化作用失活。這也可能是文獻(xiàn)報(bào)道CALB蛋白在ScCO2體系中一段時(shí)間后，就出現(xiàn)了催化活性降低的原因[18]。另外，通過(guò)對(duì)幾個(gè)體系中蛋白與超臨界流體之間的作用力分析發(fā)現(xiàn)，蛋白與CHF3之間的靜電作用力較CO2的靜電作用力大，是影響蛋白穩(wěn)定性的主要作用力。

圖8 CALB蛋白在模擬過(guò)程中的二級(jí)結(jié)構(gòu)平均含量Fig.8 Average contents of secondary structure of CALB during simulation

為了進(jìn)一步闡明在所研究的溶劑體系中CALB蛋白酶的構(gòu)象變化，考查了CALB蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)在模擬過(guò)程中的平均含量，結(jié)果如圖8所示。從圖8中可見(jiàn)，CALB蛋白在ScCHF3溶劑體系中，二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的改變，表明CALB蛋白可能出現(xiàn)了變性，與前述研究結(jié)果一致。另外，CALB蛋白在IL和IL/ScCO2體系中二級(jí)結(jié)構(gòu)基本沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，與文獻(xiàn)報(bào)道CALB蛋白在這兩個(gè)溶劑體系中的穩(wěn)定性良好的結(jié)果一致[8,10,12]。

對(duì)比CALB蛋白在IL體系和ScCO2體系中的二級(jí)結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，當(dāng)酶溶解在ScCO2中時(shí)，發(fā)生有序二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊和轉(zhuǎn)向)和無(wú)序二級(jí)結(jié)構(gòu)(卷曲)的顯著畸變，表明ScCO2對(duì)CALB蛋白酶也具有變性作用。有許多實(shí)驗(yàn)研究與上述理論研究結(jié)果一致。例如，通過(guò)圓二色性光譜研究，Ishikawa等人在35 ℃和25 MPa條件下的ScCO2中處理脂肪酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和葡糖淀粉酶，發(fā)現(xiàn)酶中的α-螺旋的含量分別降低62.9%、31.3%、37.6%和12.4%，并且酶的活性還與剩余的活性α-螺旋殘基之間存在線性關(guān)聯(lián)[19]?？梢?jiàn)蛋白質(zhì)有序二級(jí)結(jié)構(gòu)的減少是蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性減弱的主要原因，穩(wěn)定其二級(jí)結(jié)構(gòu)可獲得較好的活性和穩(wěn)定性。文獻(xiàn)[20]的實(shí)驗(yàn)研究也獲得了類似的研究結(jié)果。在本文所研究的體系中，IL、IL/ScCO2和IL/ScCHF3三個(gè)溶劑體系中CALB蛋白的有序二級(jí)結(jié)構(gòu)的減少最少，推測(cè)其具有最好的活性和穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)是生物技術(shù)中非常重要的酶。采用離子液體和超臨界流體形成的兩相體系可為其催化反應(yīng)提供一個(gè)綠色高效的溶劑體系。本文通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)方法研究了CALB蛋白酶在新型離子液體CYPHOS IL-201分別和具有極性CHF3以及無(wú)極性的CO2兩個(gè)超臨界流體形成的兩相體系中的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，離子液體CYPHOS IL-201和超臨界流體CHF3及CO2均能形成兩相體系，具有明顯的相界面，CALB蛋白始終處于離子液體相中，具有極性的CHF3分子較無(wú)極性的CO2分子更易進(jìn)入離子液體相，從而降低離子液體相的濃度和黏度。通過(guò)對(duì)CALB在模擬體系中的RMSD、RMSF、Rg、以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，在超臨界CHF3流體中，CALB蛋白發(fā)生變性是其失活的主要原因；在超臨界CO2流體中，CALB蛋白的結(jié)構(gòu)緊密性降低，有序二級(jí)結(jié)構(gòu)減少是蛋白穩(wěn)定性下降的主要原因。CHF3易破壞維持CALB蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)的N-H…O氫鍵是其導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的主要因素。離子液體CYPHOS IL-201起到了保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu)的作用，在離子液體CYPHOS IL-201與超臨界流體(CHF3、CO2)形成的兩相體系中，CALB蛋白結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定是其具有較好催化活性的主要原因。通過(guò)調(diào)整超臨界流體分子的極性，一方面保證降低離子液體粘度的程度，另一方面保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，有助于獲得更好的催化活性。