芳姜黃酮對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞遷移、侵襲及凋亡的影響和機制研究

王 葉，王麒淞，駱 衡，榮冬蕓,曹 煜

1貴州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院；2貴州醫(yī)科大學 藥用植物與利用國家重點實驗室；3貴州醫(yī)科大學中藥天然產物化學重點實驗室；4貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科，貴陽 550004

人皮膚鱗狀細胞癌(Skin squamous cell carcinoma，SSCC)是一種起源于表皮或皮膚附屬器角質細胞的惡性上皮性腫瘤，是最常見的皮膚惡性腫瘤之一[1]。皮膚鱗狀細胞癌發(fā)展快，對組織破壞力強，具有很強的侵襲力和遷移力，轉移率高達16%。目前臨床上針對皮膚鱗癌最常見的治療方式是手術切除治療，但術后復發(fā)、轉移并不少見[2]。對于已經轉移或晚期患者，化療藥物在達到正常治療量時，對人體正常細胞和器官有著巨大毒性，且如今化療期間易出現多藥耐藥問題[3]。因此，新型藥物的研發(fā)對于SSCC的治療具有重大意義。芳姜黃酮(Ar-Turmerone)已經被國內外研究學者證實對乳腺癌細胞、血液腫瘤細胞具有一定的抑制作用，并進行了相關機制研究[4,5]，但對于皮膚鱗狀細胞癌相關研究罕見報道。本研究以皮膚鱗狀細胞癌A431細胞為對象，觀察芳姜黃酮對A431細胞增殖抑制、凋亡、體外遷移、侵襲的作用，并探討芳姜黃酮是否通過Notch1/ Hes1/ PTEN通路影響皮膚鱗狀細胞癌A431的凋亡，為皮膚鱗狀細胞癌的新藥研發(fā)提供相關的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 藥品與試劑

芳姜黃酮(美國Gayman Chemical)，DMEM高糖培養(yǎng)基，PBS，青鏈霉素雙抗(美國HyClone)，四季青胎牛血清，胰酶(美國gibco)，CCK-8試劑(日本同仁)，吉姆薩染色試劑盒(中國Solarbio)，Transwell小室(美國Corning)，Matrigel膠(美國BD公司)，Annexin V-FICT/PI 細胞凋亡檢測試劑盒，RNA提取試劑盒，全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國江蘇碧云天生物科技研究所)，逆轉錄試劑盒、real-time PCR試劑盒(日本TaKa-Ra公司)，β-Actin、Notch1、Hes1、PTEN抗體(英國Abcam公司)，Lipofectamine2000(美國Invitrogen Life Technologies公司)。

1.1.3 主要儀器

多功能酶標儀SYNERGY-H4(美國Bio Tek)，DO3 THINK倒置顯微鏡，流式細胞儀(美國Becton-Dick-inson)StepOnePlus Real-Time PCR儀、E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)(美國Life Technologies)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

A431細胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，于37 ℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3～4天傳代一次，取處于對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 增殖抑制率測定

CCK-8法檢測細胞增殖抑制率。將細胞消化離心后將濃度稀釋成1×105個/mL，取50 μL接種于96孔板，設置5個復孔，待細胞貼壁后加藥。將芳姜黃酮：DMSO按100∶1配置成1 g/L母液。參照榮冬蕓[6]等的實驗方法，實驗組以等體積法計算芳姜黃酮濃度，使其終濃度為0、2.5、5、10、20、40、80、160 mg/L，終體積為100 μL。同時，設細胞對照組(除不加藥物外，處理同實驗組)、空白對照組(除不加 DMSO、藥物及細胞，余處理同實驗組)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，結束前2.5 h避光加入CCK-8試劑10 μL/孔，繼續(xù)孵育2.5 h小時后酶標儀檢測450 nm波長吸光度(A)值。

細胞增殖抑制率=(細胞對照組A450 - 實驗組A450)/(細胞對照組A450 - 空白對照組A450)×100%

1.2.3 凋亡形態(tài)觀察

消化離心收集細胞，重懸計數后以完全培養(yǎng)基稀釋至1×105個/mL，將細胞懸液接種于6孔板中(1 mL/孔)，加藥使藥物終濃度為0、20、40、80 mg/L，培養(yǎng)24 h，按照吉姆薩試劑盒方法染色，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，拍照記錄。

1.2.4 體外遷移實驗

將細胞懸液接種于6孔板，待細胞平鋪面積達80%后，用1 mL的槍頭在孔內劃痕，用PBS洗去脫落細胞，于倒置顯微鏡下對劃痕進行拍照。實驗組加藥使藥物終濃度為5、10 mg/L，設置含0.1% DMSO的培養(yǎng)基對照組，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h，再次于顯微鏡下拍照。用Image J軟件計算加藥前后劃痕面積，計算面積比。

面積比 =(加藥前初始劃痕面積-加藥24 h / 48 h后劃痕面積)/(加藥前初始劃痕面積)×100%

1.2.5 Transwell體外侵襲實驗

將配置好的Matrigel膠均勻鋪于Transwell小室內，A431細胞饑餓24 h后制備成細胞懸液。實驗組將細胞分別用濃度為5、10 mg/L的不含血清的芳姜黃酮重懸，設置含DMSO的無血清培養(yǎng)基對照組，并調整細胞濃度為5×105個/mL，取200 μL接種于鋪好膠的小室中，在下室內加入600 μL含15%血清的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育。24、48 h后用棉簽擦去小室內的細胞和膠，按照結晶紫染色試劑盒步驟染色，在倒置顯微鏡下隨機選取6個視野，顯微鏡下計數每個視野中的細胞數量，重復實驗3次。

細胞平均穿膜數量 = 6 個視野中的細胞總數 / 6

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

收集細胞后以完全培養(yǎng)基重懸，按1 mL每孔接種于6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，實驗組加入芳姜黃酮，使藥物終濃度分別為20、40、80 mg/L，設置不加藥的細胞對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。小心消化收集細胞，PBS洗滌后，參照Annexin V-FICT/ PI 試劑盒說明書操作，上流式細胞儀檢測，重復實驗3次，計算凋亡率。

1.2.7 siRNA轉染

siRNA的設計由上海吉瑪生物公司完成，lipofectamine2000 轉染技術轉染細胞。細胞轉染后無血清培養(yǎng)6 h，更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，檢測相關mRNA及蛋白表達。熒光標記siRNA(cy3-siRNA)評價轉染效率，轉染效率約為80%。轉染成功后，設置空白組(未作任何處理的A431細胞)、對照組(陰性siRNA轉染的A431細胞)，加藥組(以20 mg/L的芳姜黃酮作用于A431細胞)、siRNA組(siRNA轉染細胞)，siRNA+藥物組(以20 mg/L的芳姜黃酮作用于轉染后的A431細胞)。檢測Notch1、Hes1和PTEN的mRNA及蛋白表達，流式細胞儀檢測沉默PTEN后細胞的凋亡率。

1.2.8 real-time PCR檢測mRNA表達

使用Trizol試劑從細胞中分離出RNA。根據逆轉錄試劑盒的說明書逆轉錄總RNA，然后使用real-time PCR試劑盒和所選基因的特異性引物進行定量實時PCR。反應條件為:95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，進行40個循環(huán)。以管家基因β-actin為對照，用2-△△Ct計算相對表達水平。

1.2.9 Western blot檢測蛋白表達

將細胞在裂解緩沖液中裂解，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，10%凝膠)分離來自每個樣品的50 μg蛋白質，并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用抗Notch1、抗Hes1、抗PTEN抗體孵育。ECL發(fā)光液進行發(fā)光反應，于暗室中曝光，將條帶強度以β-actin標準化。

1.2.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 CCK-8法檢測芳姜黃酮對A431細胞增殖的影響

5～160 mg/L的芳姜黃酮作用于A431細胞24、48、72 h后，其增殖抑制率與對照組相比升高，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)；當芳姜黃酮濃度為2.5 mg/L時，三個處理時間后增殖抑制率與對照組相比均無明顯差異(P均>0.05)。當藥物濃度在10～80 mg/L時，隨作用時間的延長，增殖抑制率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，但當藥物濃度為160 mg/L時，繼續(xù)增加作用時間，增殖抑制率也無明顯變化(48 h vs 72 h，P>0.05)。芳姜黃酮在24、48、72 h的IC50分別是124.67、98.82、72.16 mg/L，結果表明實驗濃度對A431細胞的增殖具有抑制作用，且呈現一定的時間-劑量依賴性(見表1)。

2.2 芳姜黃酮對A431細胞形態(tài)的影響

對照組細胞呈多角形、排列緊密，芳姜黃酮不同濃度組細胞貼壁性降低，細胞間隙增寬，形態(tài)改變，可見核固縮、核碎裂和核溶解，上述現象隨藥物濃度增加更為明顯(見圖1)。

2.3 芳姜黃酮對A431細胞遷移能力的影響

與對照組相比，實驗組細胞遷移能力降低，差異有統(tǒng)計學意義(24 h時P<0.05，48 h時P<0.01)，提示隨芳姜黃酮濃度增高，培養(yǎng)時間增加可抑制A431細胞遷移(見圖2)。

表1 芳姜黃酮對A431細胞增殖抑制率的影響

注：與對照組相比，**P<0.01；與24 h相比，##P<0.01；與48 h相比，▽▽P<0.01。

Note:compare with the control group,**P<0.01;compare with the 24 h group,##P<0.01;compare with the 48 h group,▽P<0.01.

圖1 芳姜黃酮(0、20、40、80 mg/L)處理48 h對A431細胞形態(tài)變化的影響Fig.1 Effects of Ar-Turmerone (0,20,40,80 mg/L,48 h) on the morphological changes of A431 cells注：A:對照組(倒置顯微鏡下，×400)；B-D:20、40、80 mg/L芳姜黃酮處理細胞(倒置顯微鏡下，×400)，箭頭處示細胞核Note:A:control group(inverted microscope,×400);B-D:20,40,80 mg/L Ar-Turmerone treated cells(inverted microscope,×400),the arrow shows the nucleus.

圖2 芳姜黃酮(5、10 mg/L)、DMSO組作用于A431細胞(24、48 h)后橫向遷移圖Fig.2 Lateral migration plots of A431 cells after Ar-Turmerone (5,10 mg/L) and DMSO treatment (0,24,48 h)注：A：A431細胞橫向遷移代表性圖像(倒置顯微鏡下，×100)；B：芳姜黃酮與DMSO組細胞遷移統(tǒng)計(倒置顯微鏡下，×100)。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。Note:A :A431 cells lateral migration representative plot(inverted microscope,×100);B:Ar-Turmerone (5,10 mg/L) group and DMSO group cell migration statistics(inverted microscope,×100).Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

2.4 芳姜黃酮對A431細胞侵襲能力的影響

實驗組A431細胞與對照組相比穿膜細胞數量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，且隨作用時間延長，細胞穿膜數量逐漸減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，提示隨芳姜黃酮濃度升高，作用時間延長可抑制A431細胞的侵襲(見圖3)。

圖3 芳姜黃酮(5、10 mg/L)、DMSO組作用于A431細胞(24、48 h)后侵襲能力圖Fig.3 A431 cell invasion capacity affected by Ar-Turmerone (5,10 mg/L) and DMSO treatment (24,48 h)注：A：A431細胞侵襲能力代表圖像(倒置顯微鏡下，×200)；B：Ar-Turmerone (5、10 mg/L)與DMSO組細胞侵襲統(tǒng)計，與對照組相比，**P<0.01。Note:A:A431 cells invasion capacity represents plots(inverted microscope,×200);B:Ar-Turmerone(5,10 mg/L) and DMSO group cell invasion statistics.Compared with control group,**P<0.01.

2.5 芳姜黃酮對A431細胞凋亡率的影響

20、40、80 mg/L藥物濃度時的A431細胞凋亡率分別為(8.30±0.36)%、(16.37±0.46)%、(30.48±1.08)%,與對照組(0.02±0.01)% 相比凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)(見圖4)。

圖4 芳姜黃酮(0、20、40、80 mg/L)作用于A431細胞(48 h)后凋亡率圖Fig.4 A431 cell apoptotic rate affected by Ar-Turmerone (0、20、40、80 mg/L) treatment (48 h)注：A-D:A431細胞凋亡代表圖像；A：對照組；B-D：芳姜黃酮濃度為20、40、80 mg/L時的凋亡圖像。Note:A-D:A431 cells apoptotic representative plot;A:Control group;B-D:Ar-Turmerone (20,40,80 mg/L) group apoptotic rate.

2.6 芳姜黃酮對A431細胞Notch1和Hes1、PTEN mRNA和蛋白表達的影響

隨藥物濃度增加，Notch1、Hes1和PTEN 的mRNA和蛋白表達的量與對照組相比逐漸上調，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。Pearson分析顯示Notch1、Hes1、PTEN的蛋白表達與藥物濃度呈正相關關系(r=0.694、0.937、0.982，P<0.05和P<0.01)(見圖5)。

2.7 siRNA沉默Notch1、Hes1和PTEN后對下游靶基因和蛋白的影響

陰性 siRNA轉染細胞后，相應蛋白表達與空白組相比無差異(P均>0.05)，siRNA成功轉染細胞后，相應蛋白表達下調，與空白組相比有差異(P均<0.01)。沉默Notch1后，si Notch1+ 芳姜黃酮組Hes1的mRNA和蛋白表達與加藥組相比下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；沉默Hes1表達后，si Hes1+ 芳姜黃酮組PTEN的mRNA和蛋白表達與加藥組相比下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖6)。

2.8 沉默PTEN對芳姜黃酮促凋亡作用的影響

空白對照組凋亡率(0.00±0.00)% 和陰性對照組凋亡率(0.01±0.00)% 無差異(P>0.05)。沉默PTEN后，在20 mg/L芳姜黃酮的作用下，A431細胞的凋亡率為(3.78±0.29)%，高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但是低于單純用藥組(9.23±0.65)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖7)。

3 結論

姜黃揮發(fā)油是姜黃的主要成分，本團隊在前期研究中已經證實姜黃揮發(fā)油可以通過調節(jié)casepase 3、casepase 9、survivin等凋亡相關蛋白的表達促進皮膚鱗狀細胞癌細胞的凋亡[7-8]。芳姜黃酮是姜黃揮發(fā)油的有效部位之一，其含量在姜黃揮發(fā)油中達到30%以上[9]，姜黃揮發(fā)油促進皮膚鱗癌細胞凋亡的作用是否涉及芳姜黃酮，目前尚不明確。本研究表明，芳姜黃酮對皮膚鱗癌A431細胞起到一定的抑制增殖和促進凋亡的作用，并對相關機制進行了深入探討。

圖5 芳姜黃酮(0、20、40、80 mg/L)作用于A431細胞后對Notch1、Hes1和PTEN mRNA及蛋白表達的影響Fig.5 Effects of Ar-Turmerone (0,20,40,80 mg/L) on the expression of Notch1,Hes1,PTEN mRNA and protein注：A：real-time PCR檢測Notch1,Hes1 和 PTEN mRNA的表達；B：Western blot檢測Notch1,Hes1 和 PTEN蛋白表達；C：蛋白表達量的定量分析；D：藥物濃度與蛋白表達量的pearson相關性分析。A，C：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。Note:A:real-time PCR detects the mRNA expression of A431 cells Notch1、Hes1 and PTEN;B:Western blot detects the protein expression of A431 cells Notch1,Hes1 and PTEN;C:Quantitative analysis of protein expression.D：Pearson correlation analysis between drug concentration and protein expression;A,C:Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

圖6 siRNA沉默Notch1、Hes1和PTEN后對下游靶基因、蛋白的影響Fig.6 Effects of lower Notch1,Hes1 and PTEN expression on the expression of Notch1,Hes1 and PTEN mRNA and protein注：A,B：Western blot檢測Notch1,Hes1和 PTEN沉默后對應的蛋白表達變化；C,D,E：real-time PCR和Western blot檢測Notch1沉默后芳姜黃酮對Hes1 mRNA和蛋白的表達影響及 Hes1沉默后芳姜黃酮對PTEN mRNA和蛋白的表達；B,C,E：**P<0.01。Note:A,B:Western blot detects the lower expression of Notch1,Hes1 and PTEN,the protein expression of A431 cells Notch1,Hes1 and PTEN; C,D,E:real-time PCR and Western blot detects the effects of lower expression Notch1 on the expression of mRNA and protein Hes1 and the lower expression of Hes1 on the expression of mRNA and protein of PTEN ;B,C,E:**P<0.01.

此研究中，通過CCK-8實驗檢發(fā)現芳姜黃酮對皮膚鱗癌A431細胞的增殖具有抑制作用，并且呈現一定的時間-劑量依賴性，低劑量即有較明顯的抑制作用。細胞凋亡時是以DNA的降解為特征，可以觀察到核固縮、核碎裂、核溶解等現象。通過吉姆薩染色，倒置顯微鏡下可觀察到隨藥物濃度的增加，細胞逐漸失去正常形態(tài)，細胞間隙增加，黏附性降低，細胞核出現固縮，核碎裂形成的碎片逐漸增多，說明芳姜黃酮具有誘導細胞凋亡的作用。同時，流式細胞儀檢測細胞凋亡發(fā)現，隨藥物濃度的增加，A431細胞早期凋亡和晚期凋亡的細胞數量也逐漸增多，進一步說明了芳姜黃酮具有促進A431細胞凋亡的作用。細胞遷移和侵襲實驗表明，隨藥物濃度的增加，作用時間的延長，芳姜黃酮可以一定程度上抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。本實驗在研究芳姜黃酮對A431細胞遷移、侵襲的影響時，所選擇的藥物濃度為5、10 mg/L，作用時間為24、48 h。但當藥物濃度為5、10 mg/L時，作用48 h后的增殖抑制率分別為(14.12±0.66)% 和(27.07±1.60)% ，細胞增殖在較小程度上受到抑制，可能對遷移和侵襲的實驗結果有所影響，但結合多項實驗數據，研究者仍然認為芳姜黃酮可以一定程度上抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。

圖7 沉默PTEN后細胞凋亡率圖(芳姜黃酮20 mg/L，48 h)Fig.7 A431 cell apoptotic rate affected by the lower expression of PTEN(Ar-Turmerone 20 mg/L，48 h)注：A：空白對照組；B：陰性對照組；C：芳姜黃酮濃度為20 mg/L時的凋亡圖像；D：PTEN被抑制后，芳姜黃酮濃度為20 mg/L時的凋亡圖像。Note:A:Blank control group;B:Negative control group;C:Ar-Turmerone 20 mg/L group apoptotic rate;D:The lower expression of PTEN,and Ar-Turmerone 20 mg/L group apoptotic rate.

細胞凋亡的發(fā)生取決于促凋亡和抑凋亡成員的相對濃度。Notch 基因最早于1917年由 Thomas Hunt Morgan 在果蠅中發(fā)現，因其功能的部分缺失會在果蠅翅膀的邊緣造成切跡而命名[10]。Notch信號通路是一個在進化上十分保守的跨膜受體蛋白家族，Notch信號通路的激活在控制細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等方面發(fā)揮著重要作用[11,12]。在過去十年的研究中發(fā)現，Notch信號通路相關蛋白在急性T淋巴細胞白血病、宮頸癌及乳腺癌中都有相關表達。毛秋霞等[13]學者曾研究報道，Notch蛋白表達的異常與銀屑病、惡性黑色素瘤、炎癥性皮膚病等多種皮膚疾病相關；而Notch信號通路的缺失可能導致皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)生[14,15]。Zhang M等[16]學者研究發(fā)現，皮膚鱗癌細胞中Notch1表達和激活水平均較低。Hes1是Notch1的下游靶基因，其活化和抑制均受到Notch1的調控。PTEN為一種新發(fā)現的抑癌基因，其調控受到多種因素的影響。Kim SJ等[17]研究發(fā)現，可通過調節(jié)Notch信號通路影響PTEN的表達，從而抑制胃癌的發(fā)生。因此，芳姜黃酮是否通過Notch1/ Hes1/ PTEN信號通路促使皮膚鱗狀細胞癌A431細胞凋亡是值得探討的問題。本研究通過siRNA質粒沉默Notch1基因和Hes1基因，用合適的藥物濃度干預轉染后的細胞，檢測基因和蛋白表達的變化。在成功沉默Notch1后，Hes1的基因和蛋白表達量明顯下調，而在沉默Hes1后，PTEN的基因和蛋白表達量也呈下調趨勢，同樣沉默PTEN后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率與對照組相比明顯下降。因此，研究者認為芳姜黃酮可能是激活了Notch1，進而導致Hes1和PTEN的激活，發(fā)揮促進腫瘤細胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現芳姜黃酮不僅能夠抑制A431細胞的增殖，誘導其凋亡，還能夠抑制其侵襲和轉移的能力。綜上所述，Notch1/Hes1/PTEN途徑的激活是芳姜黃酮誘導皮膚鱗狀細胞癌A431細胞凋亡可能的機制，實驗豐富了芳姜黃酮在皮膚腫瘤的治療上應用的理論基礎，為治療皮膚鱗癌提供了新的作用靶點。