黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油對(duì)油酸致大鼠急性肺損傷的影響及其機(jī)制

丁雁南，楊 艷，李 姣

1遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遵義 563099；2遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，遵義 563003

毛蒟Piperpuberulum(Benth.) Maxim是一種胡椒科胡椒屬植物，具有芳香氣味，其普遍含有揮發(fā)油[1]。有研究表明胡椒根揮發(fā)油在鎮(zhèn)痛、抗炎和鎮(zhèn)靜中具有重要作用[2]，然而目前關(guān)于黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油的抗炎活性還缺乏相關(guān)研究。急性肺損傷主要是由于機(jī)體在受到嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克等打擊后發(fā)生的肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肺泡和肺間質(zhì)的水腫，進(jìn)而發(fā)生進(jìn)行性低氧血癥或呼吸衰竭[3]。急性肺損傷后機(jī)體內(nèi)的肺泡巨噬細(xì)胞脂肪含量會(huì)明顯增加，同時(shí)血液中油酸水平也會(huì)發(fā)生明顯升高[4-7]。在急性肺損傷模型中多采用油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷[8]。有研究顯示，p38MAPK信號(hào)通路在脂多糖、高氧以及油酸等誘導(dǎo)的動(dòng)物肺損傷中起著重要作用[9]。p38MAPK 信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系，炎癥刺激可激活p38MAPK，而p38MAPK也可以調(diào)節(jié) TNF-α、IL-1、IL-6 等致炎因子與 IL-12 等抗炎因子的生成，影響生物體內(nèi)致炎與抗炎因素的平衡，從而決定炎癥進(jìn)程。故本實(shí)驗(yàn)采用油酸誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，觀察炎性介質(zhì)、肺血管通透性指標(biāo)、p38MAPK信號(hào)通路等指標(biāo)的變化以及采用黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油干預(yù)后對(duì)其產(chǎn)生的影響，探討黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油對(duì)油酸致大鼠急性肺損傷的影響及其機(jī)制，并為臨床上急性肺損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物

黔產(chǎn)毛蒟由遵義醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室楊建文教授鑒別，黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油由遵義醫(yī)學(xué)院藥劑學(xué)教研室自制。稱取經(jīng)粉碎的黔產(chǎn)毛蒟藥材適量，置于圓底燒瓶中，按一定料液比(藥材質(zhì)量/去離子水體積，g/mL)加入去離子水和沸石若干，搖勻，浸泡一定的時(shí)間。連接好揮發(fā)油提取器及球形冷凝管，從冷凝管的上端加水至揮發(fā)油提取器中，直至充滿蒸餾水并幾乎溢流到圓底燒瓶為止。打開(kāi)控溫電熱套進(jìn)行加熱，加熱至第1 滴液滴從冷凝管管口滴下時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，并始終保持微沸。微沸一定時(shí)間后停止加熱，放置片刻，開(kāi)啟揮發(fā)油提取器下端的活塞，將水緩緩加入到油層下端至0 刻度線上5 mm處，再放置一段時(shí)間，繼續(xù)放水使油層下降到下端與0 刻度線平行，準(zhǔn)確讀取揮發(fā)油的體積。收集該揮發(fā)油，用無(wú)水硫酸鈉脫水，置于-18 ℃冰箱中保存，備用。計(jì)算揮發(fā)油的提取率。

揮發(fā)油提取率(%)=毛蒟揮發(fā)油體積(mL)/毛蒟質(zhì)量(g)×100%

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性成年SD大鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重為220±20 g，動(dòng)物合格證號(hào)：002569。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被安置在一個(gè)12 h的光線與黑暗循環(huán)交替的溫度控制的環(huán)境，按實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)自由地隨意飲食和水。實(shí)驗(yàn)由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南進(jìn)行。

1.3 試劑

油酸購(gòu)于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)(批號(hào)：1001154572)；大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫法試劑盒(批號(hào)：206384725)；考馬斯亮藍(lán)法蛋白測(cè)定試劑盒(批號(hào)：206393763)和Polink-2plus免疫組化檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：206374335)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗p38MAPK(批號(hào)：109535)；p-p38MAPK(批號(hào)：109243)和山羊抗GAPDH多克隆抗體(批號(hào)：109724)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.4 儀器

721型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(中國(guó)上海申化儀表自控公司)；-80 °C低溫冰柜(德國(guó)Forma Scientic公司)；Milli QA純水處理器(美國(guó)Millipore公司)；3K30型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；電子分析天平(中國(guó)北京賽多利斯電子天平有限公司)、凝膠成像儀(美國(guó)BioRad公司)；轉(zhuǎn)移槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；蛋白電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物模型和分組

將SD大鼠按照體重隨機(jī)分為5組，每組為10只。對(duì)照組:經(jīng)右側(cè)頸靜脈注入生理鹽水(normal saline，NS) 0.2 mL/kg,30 min后再注射NS 0.2 mL/kg。油酸組：經(jīng)右側(cè)頸靜脈注入油酸0.2 mL/kg，復(fù)制大鼠急性肺損傷模型，建模前30分鐘從靜脈注射NS(劑量與毛蒟揮發(fā)油組中的毛蒟揮發(fā)油的液體劑量一致)。毛蒟揮發(fā)油組(0.125、0.25、0.5 mL/kg)：經(jīng)右頸靜脈注射油酸0.2 mL/kg建立急性肺損傷模型前30 min，根據(jù)不同分組從頸靜脈注入毛蒟揮發(fā)油0.125、0.25、0.5 mL/kg。動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)8 h前禁食，4 h前禁水，3.5%水合氯醛溶液1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后經(jīng)右頸靜脈注入油酸建模，3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于建立模型后4 h頸動(dòng)脈放血處死，采集血標(biāo)本進(jìn)行血?dú)夥治觥?/p>

1.5.2 血?dú)夥治龊秃粑l率測(cè)定

采用NOVA血?dú)夥治鰞x檢測(cè)各組大鼠中動(dòng)脈血血?dú)夥治鲋担╬H、PaCO2和PaO2等。

1.5.3 右下肺濕干重比值和肺系數(shù)的測(cè)定

在處死大鼠后，取出肺臟并稱重，肺系數(shù)=肺重量/體重×100%；然后將右下肺置于80 ℃的恒溫烤箱烘烤3天后稱重，右下肺濕干重比值=右下肺濕重/干重。

1.5.4 肺通透指數(shù)測(cè)定

在處死大鼠后，留取血清標(biāo)本并測(cè)量其蛋白含量，然后收集支氣管肺泡灌洗液，并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白含量，肺通透指數(shù)=支氣管肺泡灌洗液蛋白/血清蛋白。

1.5.5 支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量的測(cè)定

采用ELISA法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子的水平，在收集各組支氣管肺泡灌洗液后，使用ELISA試劑盒檢測(cè)各炎癥因子的濃度，并嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書操作，并使用酶標(biāo)儀檢測(cè)于450 nm的吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度。

1.5.6 病理學(xué)檢測(cè)

將大鼠右肺上葉取出后，采用生理鹽水漂洗，4%多聚甲醛固定，48 h后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片制成5 μm厚度切片，經(jīng)脫蠟按照蘇木精-伊紅染色步驟染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)形態(tài)改變并拍照。

1.5.7 肺組織p-p38MAPK免疫組化測(cè)定

肺組織切片、3% H2O2孵育10分鐘，PBS沖洗、加入兔抗p-p38MAPK一抗(1∶50)，4 ℃過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗，37 ℃孵育20 min，DAB顯色，然后采用蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.5.8 Western blot

取肺組織100 mg，加入2 mL單去污劑細(xì)胞裂解液，離心后取上清。采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。兔抗p-p38MAPK和p38MAPK為一抗(1∶50)。采用Quantity one ChemiDocXRS系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血?dú)夥治龊秃粑l率的測(cè)定

與對(duì)照組相比，油酸組大鼠呼吸頻率增快，PaO2及氧合指數(shù)均降低(P<0.01)；毛蒟揮發(fā)油組相比油酸組PaO2及氧合指數(shù)均明顯升高(P<0.01)。這說(shuō)明毛蒟揮發(fā)油組有明顯的肺保護(hù)作用。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠RR，PaO2和PaO2/FiO2比較

注：與模型組比較**P<0.01 (下同)。

Note:Compare with volatile oil model group,**P< 0.01(similarly hereinafter).

2.2 右下肺濕干重比、肺系數(shù)和通透指數(shù)的比較

油酸組中右下肺濕干重比、肺系數(shù)和肺通透指數(shù)比對(duì)照組均明顯增加(P<0.01)。毛蒟揮發(fā)油組相比油酸組右下肺濕干重比、肺系數(shù)和肺通透指數(shù)均明顯減少(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

2.3 支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子含量的比較

油酸組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；毛蒟揮發(fā)油組相比油酸組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量明顯下降(P<0.01)(見(jiàn)表3)。

2.4 肺組織病理學(xué)改變

與對(duì)照組比較，油酸組光鏡下可見(jiàn)明顯肺泡和肺間質(zhì)水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺組織結(jié)構(gòu)破壞，然而在毛蒟揮發(fā)油組(0.125 mL/kg)中可見(jiàn)其肺泡和肺間質(zhì)水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺組織結(jié)構(gòu)破壞均明顯減輕(見(jiàn)圖1)。

表2 各組大鼠右下肺濕干重比值和肺系數(shù)的比較

表3 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的比較

圖1 肺組織病理改變(HE×100)Fig.1 Histopathological changes of lung tissue in three groups(HE×100),注：A為對(duì)照組，B為油酸組，C為毛蒟揮發(fā)油組(0.125 mL/kg)。Note:(A)Control group,(B)Oleic acid model group,(C) volatile oil group(0.125 mL/kg).

2.5 肺組織p-p38MAPK免疫組化改變

p-p38MAPK蛋白陽(yáng)性反應(yīng)在細(xì)胞胞核和胞漿中均有染色。在對(duì)照組中主要分布在氣道粘膜上皮和肺泡上皮細(xì)胞且陽(yáng)性細(xì)胞少，詳見(jiàn)圖2A和2B；在油酸組中主要分布在氣道粘膜上皮、肺泡上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮血管細(xì)胞等且陽(yáng)性細(xì)胞多，詳見(jiàn)圖2C和2D；在毛蒟揮發(fā)油組(0.125 mL/kg)中陽(yáng)性細(xì)胞較油酸組則明顯減少(見(jiàn)圖2E和2F)。

2.6 Western blot測(cè)定肺組織p38MAPK蛋白表達(dá)

油酸組p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；毛蒟揮發(fā)油組相比油酸組p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.01)；各組間p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)(見(jiàn)表4,圖3)。

圖2 肺組織p-p38MAPK免疫組化改變(A、C、E:IHC×200;B、D、F:IHC×400)Fig.2 Immunohistochemistry of lung tissue in three groups (A,C,E:IHC×200;B,D,F:IHC×400),注：A和B為對(duì)照組，C和D為油酸組，E和F為毛蒟揮發(fā)油組(0.125 mL/kg)。Note:(A and B) Control group,(C and D) Oleic acid model group (E and F),volatile oil group (0.125 mL/kg).

表4 各組大鼠肺組織p-P38MAPK相對(duì)含量比較

圖3 各組大鼠肺組織p-p38MAPK相對(duì)含量比較(p-p38MAPK/p38MAPK)Fig.3 The protein level of p38MAPK and p-p38MAPK in lung tissues

3 討論

油酸模型是急性肺損傷的經(jīng)典模型，能夠在病因上模擬肺損傷情況[10]。本研究結(jié)果中，與對(duì)照組相比，大鼠頸靜脈注入油酸后出現(xiàn)了一系列病理變化，包括呼吸頻率明顯增快以及光鏡下顯微結(jié)構(gòu)的明顯改變，在血?dú)夥治龇矫?，油酸組PaO2明顯下降，肺濕干重比值則明顯升高，以上結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[11]相符，說(shuō)明成功建立油酸誘導(dǎo)急性肺損傷動(dòng)物模型。

急性肺損傷在早期變化主要是肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷導(dǎo)致對(duì)蛋白和液體的通透性增強(qiáng)，從而發(fā)生肺泡內(nèi)外液體失衡。有研究顯示這種通透性增強(qiáng)和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷密切相關(guān)。肺通透指數(shù)作為評(píng)價(jià)急性肺損傷肺泡水腫和肺損傷的重要指標(biāo)[12]。在本研究中油酸模型組肺通透指數(shù)、肺濕干重比值和肺系數(shù)較對(duì)照組有明顯升高，這能夠體現(xiàn)油酸能夠增加肺血管通透性和肺水腫情況。

急性肺損傷中的炎癥反應(yīng)和肺功能以及內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)。在致炎因素的刺激下，機(jī)體中炎癥細(xì)胞被激活，并促進(jìn)TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的釋放。TNF-α能夠介導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化，并進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺組織損傷[13]。在本研究中油酸組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量較對(duì)照組明顯升高；毛蒟揮發(fā)油組相比油酸組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量明顯下降。這說(shuō)明毛蒟揮發(fā)油能夠通過(guò)減少炎癥因子的釋放發(fā)揮肺損傷保護(hù)作用。

急性肺損傷和機(jī)體內(nèi)多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)有關(guān)，其中p38MAPK通路作為重要的炎癥通路在急性肺損傷中也發(fā)揮著重要作用[14]。研究顯示p38MAPK能夠被多種炎癥因子、脂多糖、油酸、蛋白合成抑制劑、應(yīng)激刺激和細(xì)菌病原體等激活，然后參與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡[15]。Liu[16]等研究表明SB203580能夠通過(guò)NF-κB通路減輕了脂多糖誘導(dǎo)的動(dòng)物肺損傷。

本研究中免疫組化結(jié)果顯示油酸組中p-p38MAPK蛋白陽(yáng)性反應(yīng)主要分布在氣道粘膜上皮、肺泡上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮血管細(xì)胞等且陽(yáng)性細(xì)胞多， 在毛蒟揮發(fā)油組中陽(yáng)性細(xì)胞較油酸組則明顯減少。同時(shí)免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)油酸組p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高；毛蒟揮發(fā)油組相比油酸組p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降。同時(shí)毛蒟揮發(fā)油組相比油酸組右下肺濕干重比、肺系數(shù)和肺通透指數(shù)均明顯減少。這說(shuō)明黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油對(duì)油酸型急性肺損傷有較好的肺保護(hù)作用；黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油明顯減少油酸型急性肺損傷大鼠肺組織中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平，表明油酸型急性肺損傷中，p38MAPK磷酸化參與了炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)了肺損傷。

在外界因素的刺激下MAPKKK-MAPKK -MAPK能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，介導(dǎo)ERK、蛋白酪氨酸激酶和p38絲裂原活化蛋白激酶的活化，進(jìn)而促進(jìn)TNF-α、IL-6和IL-1β等多種炎癥因子的釋放[17]。在本研究中油酸能夠激活肺損傷中肺細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路，然后促進(jìn)多種炎癥因子釋放，而黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油能夠通過(guò)阻滯p38MAPK信號(hào)通路進(jìn)而減少炎癥因子釋放并發(fā)揮肺損傷保護(hù)作用。

總之，在油酸型急性肺損傷中，p38MAPK磷酸化明顯增加，采用黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油治療后能夠明顯抑制p38MAPK的磷酸化，抑制肺損傷組織的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放，減輕肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，對(duì)油酸型急性肺損傷有顯著的肺保護(hù)作用，表明黔產(chǎn)毛蒟揮發(fā)油通過(guò)抑制p38MAPK通路發(fā)揮作用。