紅豆樹葉揮發(fā)油化學(xué)成分及其抗氧化和抑菌活性研究

翟大才，姚建林，王文娟，尹 霞，李 繼，奚曉飛，任夢強，柏曉輝*

1黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，黃山 245041；2 安徽省林業(yè)廳科技處，合肥 230001

紅豆樹(OrmosiahosieiHemsl.Et Wils.)為豆科紅豆樹屬半常綠或落葉喬木，中國特有樹種[1]，國家II級重點保護植物；紅豆樹的根、莖、葉等皆可入藥，具有理氣、治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等功效[1]。紅豆樹自然分布于浙江、福建、江蘇、湖北及四川等地，安徽有零星栽培[2]。紅豆樹有隔年結(jié)果現(xiàn)象，一般3～5年才開花結(jié)果一次，且種子產(chǎn)量較低；同時由于其種子堅硬，種皮透水性差，造成紅豆樹種子發(fā)芽困難，導(dǎo)致其自然更新較難[1]。另外，該樹木材質(zhì)地堅硬、紋理美觀、耐腐蝕，是目前中國紅木家具中最主要的木材原料，因常被砍伐用于制作各種高檔家具、裝飾品等，造成其資源稀少。近些年來，在人們的大力保護和研究下，其資源雖得到了有效保護，但天然種群依然很少[3]。

目前，紅豆樹的研究主要集中在紅豆樹的育苗與造林、生長特性及天然紅豆樹林調(diào)查等[1]，而紅豆樹葉的成分及其抗氧化和抗菌性能等的研究還處于空白階段。因此，課題組以紅豆樹葉為材料，通過水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油，采用GC-MS對揮發(fā)油成分進行分析，并測定其對DPPH和ABTS自由基的清除能力及抑菌活性，以期為紅豆樹葉資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

實驗中所用紅豆樹葉于2018年5月采自安徽省黃山市歙縣，經(jīng)黃山學(xué)院潘健博士鑒定為紅豆樹(OrmosiahosieiHemsl.Et Wils.)的葉子(憑證標(biāo)本采集號-03；采集人：翟大才；采集地：安徽歙縣；采集時間：2018年5月)。

實驗所用菌株購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和大腸桿菌(Escherichiacoli)，以上菌種保存于黃山學(xué)院微生物學(xué)實驗中心。抑菌活性實驗使用LB(Luria-Bertani)平板培養(yǎng)基，制備方法參見文獻[4]的方法。

1.1.2 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890A-5975C型，美國 Agilent 公司)、超凈工作臺(ZHJH-C1106B型，上海智城分析儀器公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(SQ510C，重慶雅馬拓科技有限公司)、電子天平(AE224，上海恒平科學(xué)儀器有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(ZGP-2050，上海智城分析儀器有限公司)、紫外可見分光光度計(UV754N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，東京化成工業(yè)株式會社)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，東京化成工業(yè)株式會社)；無水乙醚、無水硫酸鈉、乙醇(95%)、過硫酸鉀、丙酮等為分析純，購于上海國藥集團；酵母提取物、蛋白胨、維生素C(Vc)、瓊脂等生化試劑購自上海生工生物工程有限公司。對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben，PP)，購于Sigma-Aldrich公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 揮發(fā)油提取

稱取粉碎后的新鮮紅豆樹葉60.0 g置于圓底燒瓶中，加入300 mL經(jīng)兩次蒸餾的雙蒸水，按水蒸氣蒸餾法提取6 h并收集乙醚層，揮發(fā)乙醚溶劑，加入無水硫酸鈉干燥，得到香味濃郁的淡黃色透明油狀物；按照此法分別提取12組樣品，得率為0.16%。取1.0 μL干燥后的揮發(fā)油用無水乙醚稀釋后進行GC-MS分析，同時取部分揮發(fā)油稀釋至不同濃度后測定其抗氧化和抑菌活性，并將余下的揮發(fā)油密封后4 °C保存。

1.2.2 揮發(fā)油GC-MS分析

GC分析條件：色譜柱為HP-5 MS 石英毛細(xì)管柱(30 m × 250 μm × 0.25 μm)；高純氦氣(99.999 %)為載氣，載氣流速為1.0 mL /min，進樣量為 0.5 μL，進樣口溫度為 290 °C；柱箱采用程序升溫，起始溫度50 °C，以2.5 °C /min升至170 °C保持3 min，再以6 °C /min 升至 285 °C保持10 min，運行時間為 83 min。

MS分析條件：電子轟擊(EI)離子源，離子源溫度為 230 °C，四極桿溫度為150 °C，電子能量為70 eV；溶劑延遲 3.0 min，質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z為50.0～500.0，選擇譜庫NIST08為質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

1.2.3 揮發(fā)油對DPPH自由基清除能力的測定

對DPPH自由基清除能力的測定，參照文獻[5]并適當(dāng)進行了修改。取經(jīng)丙酮稀釋至不同濃度的紅豆樹葉揮發(fā)油100 μL，分別加到4 mL 0.06 mmol /L DPPH-乙醇(95%)溶液的溶液中，配制成濃度分別為0.00、0.07、0.14、0.21、0.28、0.35 mg /mL，混勻并避光反應(yīng)20 min，于波長517 nm 處測定吸光值(Ax) 。以加入100 μL丙酮的DPPH乙醇溶液為對照組，測定對照組吸光值(A0) 。以Vc為陽性對照，每樣重復(fù) 3 次，取平均值，并按公式(1)計算DPPH自由的清除率。

清除率(%)=(1-Ax/A0)× 100%

(1)

1.2.4 揮發(fā)油對ABTS自由基清除能力的測定

對ABTS自由基清除能力的測定，參照文獻[6]方法并適當(dāng)進行了修改。按體積比1∶1取2.45 mmol /L過硫酸鉀與7 mmol /L ABTS溶液混合均勻并于暗處反應(yīng)12 h。用甲醇將反應(yīng)后的ABTS溶液稀釋為734 nm處吸光值0.68～0.72。分別取不同濃度的紅豆樹葉揮發(fā)油200 μL加入2 mL ABTS溶液，配制成濃度分別為0.00、0.13、0.26、0.39、0.52、0.65 mg /mL的溶液，混勻后反應(yīng)6 min，并測量其吸光值(Ax)。測量200 μL甲醇與2 mL ABTS溶液混合后的吸光值(A0) 。測量200 μL不同濃度揮發(fā)油樣品與2 mL甲醇溶液的吸光值(Ay)。按公式(2)計算清除率。

清除率(%)=[(A0-Ax+Ay) /A0]× 100%

(2)

1.2.5 揮發(fā)油抑菌活性的測定

抑菌活性的測定，參考文獻[4]的方法，并適當(dāng)修改。用新制備的 LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基分別將活化后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌培養(yǎng)至600 nm處吸光值(OD600)為0.2～0.3，分別吸取100 μL菌液涂布于新制備的LB平板培養(yǎng)基上，并貼上無菌濾紙片(直徑 6 mm)。移取10 μL揮發(fā)油分別滴加于無菌濾紙片中央，并以丙酮為空白對照、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben，PP)為陽性對照。將此LB平板培養(yǎng)基于37 °C培養(yǎng)12～14 h，測量抑菌圈直徑的大小并記錄，實驗結(jié)果重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆樹葉揮發(fā)油化學(xué)成分的分析

2.1.1 紅豆樹葉揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

利用GC-MS對紅豆樹葉揮發(fā)油成分進行分析，通過對譜庫NIST08檢索、質(zhì)譜分析確定揮發(fā)油的化學(xué)成分，并采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，其總離子流結(jié)果如圖1，離子流結(jié)果具體分析結(jié)果見表1。由圖1和表1結(jié)果知，從紅豆樹葉揮發(fā)油中共分離出77個色譜峰，鑒定出36個化合物，占揮發(fā)油總量的90.50%。已鑒定出的36個化合物包含烯、醇、烷、醛、酮、酯等，其中含量高于2.00%的化合物有1,4-二十烷二烯(25.72%)、1,19-二十烷二烯(10.85%)、2,6-二叔丁基對甲酚(10.14%)、鄰苯二甲酸正丁基異丁基酯(9.75%)、(Z,Z)-6,9-二十烷二烯(7.60%)、(E,E)-α-金合歡烯(7.51%)、葉醇(4.74%)和2-異丙烯基-5-甲基-6-庚烯-1-醇(4.04%)，這8種成分占揮發(fā)油總量的80.35%。

圖1 紅豆樹葉揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram of the volatile oil from O.hosiei Hemsl.Et Wils.leaves

表1 紅豆樹葉揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

續(xù)表1(Continued Tab.1)

編號No.保留時間Retention time (min)化合物Compound分子式Molecular formula相對含量Relative content(%)1126.9064-亞硝基苯甲酸乙酯 Ethyl 4-nitrosobenzoateC9H9NO30.091230.1401,5,8-三甲基四啉 1,5,8-Trimethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthaleneC13H180.181330.3741,1,6-三甲基-1,2-二氫萘 1,1,6-Trimethyl-2H-naphthaleneC13H160.261431.837β-大馬士酮β-DamascenoneC13H18O0.371533.568β-石竹烯β-CaryophylleneC15H240.621635.355(Z,Z,Z)-1,5,9,9-四甲基-1,4,7-環(huán)十一碳三烯 (Z,Z,Z)-1,5,9,9-Tetramethyl-1,4,7-cycloundecatrieneC15H240.141735.527反式-β-金合歡烯 trans-β-FarneseneC15H240.131835.8682,6-二叔丁基-1,4-苯醌 2,6-Di-tert-butyl-1,4-benzoquinoneC14H20O20.471937.1197,9-二甲基十六烷 Hexadecane,7,9-dimethyl-C18H380.332037.441(3 Z,6 E)-α-金合歡烯 (3Z,6E)-α-FarneseneC15H240.582138.0482,6-二叔丁基對甲酚 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenolC15H24O10.142238.240(3E,6E)-α-金合歡烯 (3E,6E)-α-FarneseneC15H247.512338.712 (Z,E)-9,12-十四二烯-1-醇 (Z,E)-9,12-Tetradecadien-1-olC14H26O0.182439.4592-異丙烯基-5-甲基-6-庚烯-1-醇 2-Isopropenyl-5-methyl-6-hepten-1-olC11H20O4.042547.825肉豆蔻醛 TetradecanalC14H28O0.202648.675正二十烷 IcosaneC20H420.092753.2671,4-二十烷二烯 1,4-EicosadieneC20H3425.722853.359植酮 PhytoneC18H36O0.612954.318(Z,Z)-6,9-二十烷二烯 (Z,Z)-6,9-EicosadieneC20H347.603055.1891,19-二十烷二烯 1,19-EicosadieneC20H3410.853156.2286(E),10(E)-7,11,15-三甲基-3-亞甲基-1,6,10,14-十六碳四烯7,11,15-Trimethyl-3-methylenehexadeca-1,6(E),10(E),14-tetraeneC20H320.263256.908棕櫚酸甲酯 Methyl hexadecanoateC17H34O20.303357.933鄰苯二甲酸正丁基異丁基酯 Butyl isobutyl phthalateC16H22O49.753461.438亞麻酸甲酯 Methyl linolenateC19H32O20.413566.727正二十四烷 TetracosaneC24H500.633668.164正二十五烷 Pentacosane C25H520.80

2.1.2 紅豆樹葉揮發(fā)油化學(xué)成分的類型

紅豆樹葉揮發(fā)油提取物所鑒定出的7類化合物的數(shù)目和相對含量見圖2。從圖2結(jié)果可知，紅豆樹葉揮發(fā)油中烯烴類，共13種，其相對含量高達(dá)58.68%；其次為醌、酚、萘類等(6種，11.42%)、酯類(4種，10.55%)、醇類(2種，5.75%)、烷烴類(5種，2.04%)、酮類(3種，1.10%)以及醛類(3種，0.96%)。

2.2 紅豆樹葉揮發(fā)油的抗氧化作用

2.2.1 紅豆樹葉揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用

測定紅豆樹葉揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用，結(jié)果見圖3。從圖3結(jié)果可知，紅豆樹葉揮發(fā)油對DPPH自由基有清除作用；當(dāng)揮發(fā)油濃度為0.35 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率為55.78% ± 0.35%；揮發(fā)油濃度與清除率間呈正相關(guān)，隨著揮發(fā)油濃度的逐步增大，DPPH清除率逐漸增大。揮發(fā)油濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=171.71X+3.611 (R2=0.928 5)。VC濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=93 848X+3.303 4 (R2=0.988 6)。紅豆樹葉揮發(fā)油和VC對DPPH自由基清除作用的ED50值分別為0.27 mg/mL和0.000 5 mg/mL。

圖2 紅豆樹葉揮發(fā)油化學(xué)成分的類型Fig.2 Compounds type of the volatile oil from O.hosiei Hemsl.Et Wils.leaves

圖3 紅豆樹葉揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Free radical scavenging assays of the volatile oil from O.hosiei Hemsl.Et Wils.leaves against DPPH

2.2.2 紅豆樹葉揮發(fā)油對ABTS自由基的清除作用

測定紅豆樹葉揮發(fā)油對ABTS自由基的清除率，結(jié)果如圖4。從圖4結(jié)果可知，紅豆樹葉揮發(fā)油對ABTS自由基有清除能力；隨著紅豆樹葉揮發(fā)油濃度的增加，其對ABTS自由基的清除能力逐步增強，但是增幅逐漸減弱。這說明紅豆樹葉揮發(fā)油濃度與清除作用間不僅存在劑量關(guān)系，且存在濃度飽和效應(yīng)。鑒于揮發(fā)油濃度與ABTS自由基清除率間非線性關(guān)系，故采用GraphPad Prism 5.0軟件進行量-效曲線[7]擬合，并計算ED50。而Vc濃度(X)與ABTS自由基清除率(Y)間呈線性關(guān)系，其回歸方程為：Y=20 712X+1.892 4 (R2=0.964 7)。紅豆樹葉揮發(fā)油和Vc對ABTS自由基清除作用的ED50值分別為0.14 mg/mL和0.002 mg/mL。

圖4 紅豆樹葉揮發(fā)油對ABTS自由基的清除作用Fig.4 Free radical scavenging assays of the volatile oil from O.hosiei Hemsl.Et Wils.leaves against ABTS

2.3 紅豆樹葉揮發(fā)油的抑菌作用

本文檢測了紅豆樹葉揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及綠膿桿菌的抑菌活性，結(jié)果見圖5。從圖5結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，紅豆樹葉揮發(fā)油(the volatile oil)對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及綠膿桿菌均具有一定的抑菌效果。當(dāng)紅豆樹葉揮發(fā)油濃度為7.1 mg/mL時，其對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及綠膿桿菌的抑菌圈分別為11.29、9.88、10.85、11.03 mm。而作為陽性對照的對羥基苯甲酸丙酯(PP，濃度為1.0 mg/mL)的抑菌圈分別為8.18、10.85、9.78、11.58 mm。紅豆樹葉揮發(fā)油對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌均具有一定的抑制效果，且在相同濃度下抑制強度為：金黃色葡萄球菌>綠膿桿菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。

圖5 紅豆樹葉揮發(fā)油對不同受試菌的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of the volatile oil from O.hosiei Hemsl.et Wils.leaves against the tested bacteria注：抑菌實驗菌株為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌。Note:The tested bacteria contain S.aureus,B.subtilis,E.coli and P.aeruginosa.

3 結(jié)論

文章首次報道紅豆樹揮發(fā)油化學(xué)成分，并對其抗氧化和抑菌活性進行分析。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取紅豆樹葉片的揮發(fā)油，通過GC-MS共鑒定出36個化合物，占揮發(fā)油總量的90.50%。紅豆樹葉揮發(fā)油化學(xué)成分以烯、酯、醇以及含苯環(huán)類化合物為主，醛、酮和烷烴類化合物含量相對較少。

紅豆樹葉揮發(fā)油具有較強的DPPH和ABTS自由基清除能力，且其抗氧化能力與揮發(fā)油濃度呈量效相關(guān)，這可能與揮發(fā)油中含有較高的抗氧化物質(zhì)如2,6-二叔丁基對甲酚等相關(guān)。此外，紅豆樹葉揮發(fā)油對革蘭氏陽性(如金黃色葡萄球菌)和陰性菌(如大腸桿菌)均具有明顯的抑菌效果，但具體是哪種或哪些化合物發(fā)揮主要作用則需要進一步的研究，以便篩選更加有效的活性分子。因此，本研究結(jié)果可為紅豆樹資源的綜合開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。