八種石斛中苯丙醇類和香豆素類化合物含量測(cè)定與分析

師亦潔 ，周峰旭，李 鮮，范宇超，劉宏程

1昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(昆明) 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所， 昆明 650223

石斛屬(Sect.Dendrobium)隸屬于蘭科(Orchidaceae)，約有1 000種，在我國(guó)發(fā)現(xiàn)有74種和2變種，產(chǎn)秦嶺以南諸省區(qū)，尤其云南南部為多[1]。石斛作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥[2]，具有抗腫瘤[3]、增強(qiáng)免疫[4]、抗氧化[5]、緩解糖尿病[6]等多種藥理學(xué)作用。主要是石斛多糖[7、8]，酚類化合物[9]，芳香族化合物和倍半萜類化合物[10]等功能成分。

對(duì)石斛中功能成分測(cè)定方法有很多，如周曉梅等[11]對(duì)4種不同石斛中香豆素的含量進(jìn)行測(cè)定。劉妍妍等[12]對(duì)云南產(chǎn)的37個(gè)品種的石斛中的濱蒿內(nèi)酯含量進(jìn)行測(cè)定。也有研究表明，曾從鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)[13]與疊鞘石斛(Dendrobiumaurantiacumvar.denneanum)[14]中分離得到紫丁香苷。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，石斛中含有阿魏酸[15]和松伯醇[16]，松柏醇與葡萄糖成苷后即為松柏苷。但對(duì)于石斛中松柏苷與紫丁香苷等苯丙醇類化合物的含量測(cè)定則未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)首次建立了一種在不同波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定石斛屬中松柏苷和紫丁香苷兩種苯丙醇類化合物以及東莨菪內(nèi)酯、濱蒿內(nèi)酯和香豆素三種香豆素類化學(xué)物的含量分析方法。該方法以期為石斛品種的區(qū)分、質(zhì)量控制以及不同石斛品種間藥理活性的差異研究提供一種新的分析方法。

1 儀器與材料

Waters Alliance e2695型高效液相色譜(四元梯度洗脫系統(tǒng)、2489紫外檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站,美國(guó)Waters公司)；BT 25 S型分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ500-E型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

松柏苷對(duì)照品及紫丁香苷對(duì)照品(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，HPLC≥98%)，東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究所，HPLC≥98%)，濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品(北京索萊寶科技有限公司，HPLC≥98%)，香豆素對(duì)照品(北京百靈威科技有限公司，HPLC≥99%)；乙腈、甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司)； 實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水。

五種目標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示：

球花石斛、鼓槌石斛、齒瓣石斛、鐵皮石斛、流蘇石斛、金釵石斛、疊鞘石斛、束花石斛樣品均由云南熱帶作物研究院(國(guó)家石斛種資資源圃)李守領(lǐng)老師鑒定和提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

圖1 五種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of five components注：1.松柏苷；2.紫丁香苷；3.東莨菪內(nèi)酯；4.濱蒿內(nèi)酯；5.香豆素。Note:1.Cypressin；2.Syringin；3.Scutellarin；4.Scoparone；5.Coumarin.

2.1.1 雙波長(zhǎng)的選擇

通過全波長(zhǎng)掃描(210 ～ 440 nm)，可知各目標(biāo)化合物最大吸收波長(zhǎng)，見表1。通過對(duì)比各波長(zhǎng)下目標(biāo)化合物響應(yīng)，在260 nm處苯丙醇類物質(zhì)有較大吸收，但此波長(zhǎng)下的香豆素類物質(zhì)響應(yīng)較低，而在325 nm處，香豆素類物質(zhì)有較大吸收。且在這兩個(gè)波長(zhǎng)下，雜質(zhì)影響較小，故最終選定分析波長(zhǎng)為260 nm和315 nm。對(duì)照同等條件下單一對(duì)照品保留時(shí)間可知，如圖2，在兩個(gè)波長(zhǎng)下，各目標(biāo)化合物均有較好響應(yīng)。

表1 化合物最大吸收波長(zhǎng)

圖2 混合對(duì)照品HPLC圖譜Fig.2 HPLC comparison of mixed controls注：1.圖2a為260nm，圖2b為315nm；2.從左至右，峰依次為：A.松柏苷、B.紫丁香苷、C.東莨菪內(nèi)酯、D.濱蒿內(nèi)酯、E.香豆素。Note:1.Fig 2a is 260nm,Fig 2b is 315nm;2.From left to right,the peaks are A.cedarin,B.syringin,C.scutellarin,D.scoparone,E.coumarin.

2.1.2 流動(dòng)相和流速的選擇

在前期試驗(yàn)中，對(duì)比了甲醇-水以及乙腈-水體系，發(fā)現(xiàn)在乙腈-水體系下各峰峰形較好。對(duì)比了1.0、0.8、0.5 mL/min等幾個(gè)流速，發(fā)現(xiàn)在0.8 mL/min流速下，各峰能夠有較好的分離度，且分析時(shí)間適中。

2.1.3 色譜條件

Shiseido CAPCELL PAK MG Ⅱ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A):水(B)，梯度洗脫程序如下：5% A→20% A(0～20 min),20% A→30% A(20～30 min),30% A(30～40 min),30% A→5% A(40～45 min)；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm，315 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。混合對(duì)照品色譜圖見圖2。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱取各對(duì)照品5.00 mg分別置于10 mL容量瓶中，分別加入10 mL 5%乙腈定容，即得濃度為0.5 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取各單一對(duì)照品溶液各20 μL混合，即得濃度為0.1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液

2.3.1 提取條件的優(yōu)化

因香豆素類物質(zhì)不溶于冷水，易溶于熱水、醇、乙醚、氯仿等，苯丙醇類物質(zhì)溶于熱水和乙醇，微溶于冷水，而石斛中普遍含有豐富的多糖，且多糖易溶于熱水。故實(shí)驗(yàn)對(duì)比了純甲醇、80%甲醇和純水，在相同條件和時(shí)間下的提取效果，結(jié)果顯示純甲醇提取條件下各成分均能提取得較完全。實(shí)驗(yàn)還對(duì)比了單純純甲醇提取以及用水提取一次后，棄去水提部分再以純甲醇提取，結(jié)果顯示，單純先以水提取一次并不能較好除去相關(guān)干擾雜質(zhì)，且會(huì)造成一部分目標(biāo)化合物的損失，故選擇以單純純甲醇提取。測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 提取條件選擇結(jié)果(μg/g)

提取時(shí)間：對(duì)比了超聲提取20、30、40 min，結(jié)果表明30 min即可達(dá)到較好的提取效果。比較了提取1、2、3次的提取效率，結(jié)果表明，重復(fù)提取兩次即可對(duì)目標(biāo)成分提取得較為完全。

2.3.2 樣品溶液制備

分別精密稱取八個(gè)品種石斛干燥粉末1.0 g置于錐形瓶中，分別加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，重復(fù)提取兩次，合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓水浴蒸干后，用2 mL甲醇溶解，過0.45 μm水系微孔濾膜后置于進(jìn)樣瓶中備用。

2.4 檢出限和線性范圍考察

按照3倍信噪比(S/N=3)來確定儀器檢出限。將混合對(duì)照品溶液分別以初始比例流動(dòng)相稀釋1、2、5、10、20、50、100倍，分別進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，以混合對(duì)照品含量X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積As為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算。五種目標(biāo)成分的回歸方程見表2。由結(jié)果可知，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)成分均有較好的線性。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，五個(gè)目標(biāo)成分峰面積的RSD分別為0.71%、1.03%、0.61%、0.66%、0.62%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品(鼓槌石斛)6份，按“2.3”項(xiàng)下條件操作，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分析，五個(gè)成分峰面積RSD分別為0.47%、0.89%、0.34%、0.18%、0.71%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

表3 五種目標(biāo)成分回歸方程

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品溶液(鼓槌石斛)，于室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，五個(gè)成分峰面積RSD分別為0.42%、1.01%、0.74%、1.20%、1.21%。結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的樣品(鼓槌石斛)9份，每份1.0 g，按低、中、高濃度(每個(gè)濃度三份，9份)加入對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果見表3。在30～540 μg加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，平均回收率在99.80%～100.90%，RSD為0.62%～1.58%。

2.9 樣品含量測(cè)定

取“2.3”項(xiàng)下八個(gè)不同品種石斛樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

由含量測(cè)定結(jié)果(表4)可以看出，不同品種的石斛，其所含苯丙醇類和香豆素類化合物的種類及其含量均有較大差異：七種石斛中均含有紫丁香苷，僅在球花石斛中未檢測(cè)到紫丁香苷；七種石斛中均含有濱蒿內(nèi)酯，僅疊鞘石斛中未檢測(cè)到其存在；齒瓣石斛中五種目標(biāo)物質(zhì)的含量較其他幾個(gè)品種的石斛均較低；而在鼓槌石斛中五種目標(biāo)物質(zhì)含量均高于其他幾個(gè)品種。從結(jié)果可看出，相同產(chǎn)地的不同品種石斛中的有效成分種類及含量均存在較大差異，故可通過對(duì)其不同有效成分間含量的測(cè)定，對(duì)石斛的品種進(jìn)行初步的區(qū)分。

表4 加樣回收率(n=3)

表5 八個(gè)品種石斛含量測(cè)定結(jié)果(μg/g)

對(duì)香豆素類化合物含量測(cè)定結(jié)果與已有文獻(xiàn)對(duì)比：周曉梅等[11]研究結(jié)果表明其測(cè)定的4個(gè)石斛品種中僅疊鞘石斛中含有香豆素。劉妍妍等[12]研究結(jié)果顯示云南產(chǎn)37個(gè)石斛品種中僅密花石斛和球花石斛中含有濱蒿內(nèi)酯，但研究者也表示由于樣品總數(shù)較大 ，每份樣品量較少 ，在檢測(cè)過程中部分樣品只顯示痕量，未能計(jì)算出具體含量 ，故記為“未檢出”，但不能排除其他種石斛含有微量濱蒿內(nèi)酯的可能性?？梢钥闯?，這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果存在一定差異，分析原因可能是由于石斛樣品的產(chǎn)地或采收期的不同造成了這種含量差異，后期還可對(duì)相同品種不同產(chǎn)地或不同采收期的石斛中香豆素類含量進(jìn)行測(cè)定、比較，以期對(duì)市售常見石斛品種的質(zhì)量控制提供參考。

松柏苷為松伯醇的苷類化合物。松柏苷的含量研究?jī)H在筒鞘蛇菰(Balanophorainvolucrata)中可見，紫丁香苷含量研究主要集中于刺五加(Acanthopanaxsenticosus)等，也有報(bào)道從鐵皮石斛[13]與疊鞘石斛[14]中分離得到紫丁香苷。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們已選用不同流動(dòng)相體系(甲醇/水，甲醇/甲酸)以及不同流動(dòng)相比例分離樣品中紫丁香苷與松伯苷，其與混合對(duì)照品中保留時(shí)間一致(保留時(shí)間偏差小于5%)，未發(fā)現(xiàn)有其他干擾物質(zhì)。同時(shí)采用DAD對(duì)樣品中紫丁香苷和松伯苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，其吸收波長(zhǎng)與對(duì)照品的吸收波長(zhǎng)一致，可確定樣品中含有紫丁香苷和松伯苷。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)石斛中兩種苯丙醇類化合物進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果顯示大多數(shù)石斛品種中均含有這兩種物質(zhì)。

文獻(xiàn)報(bào)道，紫丁香苷具有降血脂[17]、增強(qiáng)免疫[18]、對(duì)心肌缺血保護(hù)[19]、抗氧化[20]、抗抑郁[21]等功效。而針對(duì)松柏苷的生物活性研究仍較少，僅有部分文獻(xiàn)報(bào)道其有抗氧化[22]作用。對(duì)比石斛屬已研究發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤[3]、增強(qiáng)免疫[4]、抗氧化[5]、緩解糖尿病[6]等生物活性。因此所建立的分析方法對(duì)石斛屬新的生物活性研究奠定基礎(chǔ)。