白刺花中3種生物堿的含量及HPLC指紋圖譜

張艷華，潘芳慧，何寶佳，王友保*

1安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，蕪湖 241002

白刺花Sophoradavidii(Franch.) Skeels為豆科槐屬藥用植物，又名馬鞭采、馬蹄針、白刻針、鐵馬胡燒、白花刺、狼牙槐、狼牙刺，為多年生野生灌木或小喬木，廣泛分布于海拔2500米以下的山坡、路邊和河谷等，資源十分豐富，它的根、花、葉、莖、果實(shí)均可藥用，《中華本草》和《中藥大辭典》等本草書籍中均有記載[1-2]，具有清熱、解毒、涼血，利濕消腫等功效，主治鼻血、便血、痢疾、膀胱炎、血尿、水腫等。也有人研究發(fā)現(xiàn)其具有降血糖和抗氧化活性[3-4]。前期研究表明，白刺花中主要有效物質(zhì)基礎(chǔ)是生物堿和黃酮類化合物[5-8]，其中生物堿類主要有苦參堿、槐果堿、槐定堿、槐根堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿等，針對這些成分已經(jīng)做了許多方面的研究工作[9]。目前對白刺花的研究多集中在花和果實(shí)[10-12]，其根、莖、葉中是否含有同樣的化學(xué)成分，是否具有相同的藥效尚未研究，也沒有建立有效的質(zhì)量評價方法用于控制其藥材質(zhì)量。本文采用HPLC法，建立白刺花的高效液相色譜指紋圖譜，并同時測定白刺花中苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿的含量，為白刺花的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

日本島津LC-20A高效液相色譜儀(日本島津，SPD-M20A檢測器、LC-20AT真空在線脫氣機(jī)、LC-20AT四元泵、CTO-10AS柱溫箱)，AUW-220D型電子天平(日本島津)，EYELA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，KQ5200B 型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。PHS-3C精密pH計(jì)(上海越平科學(xué)儀器有限公司)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料

白刺花實(shí)驗(yàn)藥材采自甘肅省平?jīng)鍪星f浪縣柳梁鄉(xiāng)，經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室包淑云副教授鑒定為豆科槐屬植物白刺花Sophoradavidii(Franch.) Skeels，苦參堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110805-201709)、氧化苦參堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110780-201508)、槐果堿(成都瑞芬思生物科技有限公司)，乙腈(色譜純，Merck 公司)；其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品適量于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，并各取1 mL混合稀釋得含苦參堿101.5 μg/mL、槐果堿103.5 μg/mL和氧化苦參堿100.5 μg/mL的混合對照品貯備溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

取白刺花的根、莖和葉分別粉碎，過三號篩。精密稱取各樣品約1 g，以95%乙醇連續(xù)回流提取8 h。提取液抽濾并濃縮至50 mL左右。用10%硫酸酸化濃縮液至pH3左右，用乙醚萃取酸化液取下層液。將下層液用25%氨水堿化至pH11左右，用氯仿萃取8次，每次使用氯仿50 mL，合并氯仿層液。減壓回收氯仿得浸膏，用少量甲醇溶解浸膏后，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中定容，備用，每一樣品平行制備3份。

2.2 色譜條件

采用AgilentTC-C18(2)色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，流動相乙腈∶0.09%三乙胺水溶液 (4∶96，磷酸調(diào)pH3.5)，檢測波長205 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取上述混合對照品溶液和樣品溶液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿的保留時間分別為9.4、11.8、16.7 min，各成分色譜峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5 000。色譜圖見圖1。

2.4 方法學(xué)考察及結(jié)果

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對照品混合儲備溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制成系列對照品溶液。按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到線性回歸方程(見表1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of standards (A) and a sample of S.davidii (B)注：1.苦參堿;2.槐果堿;3.氧化苦參堿。Note：1.Matrine;2.Sophocarpine;3.Oxymatrine.

表1 三種生物堿的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品混合溶液10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿的峰面積RSD(n=6)分別為0.82%、0.63%、0.32%均符合要求，表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算得苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿的峰面積RSD(n=6)分別為0.86%、1.2%、0.72%。結(jié)果表明3種生物堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批白刺花藥材6份，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定3種生物堿的含量，苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿的平均峰面積RSD(n=6)分別為1.24%、0.96%、1.38%。表明樣品測定重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱取已知含量的白刺花藥材粉末約0.5 g，共9份，分成3組，分別加入各對照品溶液適量，每個濃度平行操作3組，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下測定，計(jì)算得苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿的加樣回收率結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

成分Component樣品量Sample amount (g)樣品含量Sample content (mg/g)加入量Added(mg)測得量Measured(mg/g)回收率Recovery(%)平均回收率Average recovery (%)RSD(%)0.501 80.075 40.090 20.164 598.80.502 40.075 50.090 20.164 999.1氧化苦參堿Oxymatrine0.501 30.336 40.268 40.609 7101.8100.21.320.500 90.336 10.268 40.608 5101.40.503 20.337 60.268 40.604 199.30.501 90.336 80.335 50.667 398.50.501 40.336 40.335 50.671 299.80.502 50.337 20.335 50.669 799.10.501 60.336 60.402 60.745 6101.60.500 80.336 00.402 60.743 4101.20.502 30.337 00.402 60.734 998.8

2.5 樣品含量測定

各取3份樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定各峰面積，計(jì)算各樣品中苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(mg/g，n=3)

2.6 白刺花指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 樣品指紋圖譜的測定

取3個批次的白刺花樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣分析，記錄60 min HPLC色譜峰，圖2為白刺花根在60 min的HPLC圖譜。

2.6.2 共有峰的標(biāo)定與確認(rèn)

將3批白刺花樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”，選取時間窗寬度為0.5 min，以中位數(shù)生成對照圖譜，經(jīng)過多點(diǎn)校正后，自動匹配，得到指紋圖譜及共有模式對照指紋圖譜，見圖3和圖4，結(jié)果顯示，3批樣品的指紋圖譜匹配后相似度計(jì)算結(jié)果大于0.9，共有模式指紋圖譜中，標(biāo)定14個共有峰，構(gòu)成白刺花指紋圖譜的特征峰，3批樣品指紋圖譜中共有峰的保留時間和峰面積見表4。其中，根據(jù)圖1對照品圖譜，分別指認(rèn)出9號峰(苦參堿)、11號峰(槐果堿)、13號峰(氧化苦參堿)。

圖2 白刺花根高效液相圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of radix of S.davidii

圖3 3批白刺花的HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of 3 batches of S.davidii

圖4 3批白刺花樣品HPLC指紋圖譜共有峰Fig.4 Common peaks in HPLC fingerprints of 3 batches of S.davidii注：9 苦參堿;11 槐果堿;13 氧化苦參堿。Note：9 Matrine;11 Sophocarpine;13 Oxymatrine.

表4 3批樣品指紋圖譜中共有峰的保留時間和峰面積

3 結(jié)論

高效液相色譜法分析含有生物堿的樣品時，如果選擇C18色譜柱時，生物堿上的堿性氮原子容易與C18柱上未鍵合酸性硅醇基相互作用而導(dǎo)致色譜峰展寬拖尾，使分離效能降低，為了能屏蔽這些相互作用，常在流動相中加入一定量的堿性物質(zhì)如二乙胺、三乙胺或強(qiáng)堿弱酸鹽等，改善分離效果，但是當(dāng)流動相為堿性時，一般的鍵合相硅膠在pH大于8時即開始溶解，對色譜柱產(chǎn)生不可逆的影響，導(dǎo)致柱效下降，因此，在加入三乙胺改善峰形的同時，一般需要調(diào)節(jié)流動相pH值為弱堿性或者酸性，而不致一般鍵合硅膠溶解。在堿性時，各生物堿保持游離狀態(tài)，達(dá)到一定酸性時，生物堿處于解離狀態(tài)。通過查閱相關(guān)資料，對3種生物堿測定的流動相進(jìn)行了考察，采用甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%三乙胺(磷酸調(diào)pH值7.5)，甲醇-0.06%三乙胺(磷酸調(diào)pH值3.5)等不同比例的系統(tǒng)作為流動相，分離效果均不理想，當(dāng)甲醇濃度升高時，形成的磷酸鹽的溶解度下降，導(dǎo)致柱壓變大，靈敏度下降，檢測基線不穩(wěn)定。當(dāng)把甲醇換成乙腈后，情況明顯改善，最終確定以乙腈-0.09%三乙胺水溶液(4∶96，磷酸調(diào)pH3.5)為流動相，各生物堿得到了好的分離。

結(jié)合3種生物堿的堿性和溶解性能，本文考察了不同提取溶劑對3種生物堿提取率的影響?？鄥A和槐果堿脂溶性，溶于有機(jī)溶劑，而氧化苦參堿極性較大，易溶于水、甲醇和乙醇，為了使各生物堿都有好的溶出率，選擇用不同比例醇類溶劑和酸水溶液提取，發(fā)現(xiàn)用95%乙醇作為提取溶劑時，對3種生物堿的提取率明顯高于低濃度的醇和酸水溶液，故選擇95%的溶劑為提取溶劑。

白刺花中三種生物堿的含量測定結(jié)果顯示，白刺花根、莖、葉中均含有苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿，根和莖中氧化苦參堿的含量明顯高于苦參堿和槐果堿，槐果堿含量最低；而葉中氧化苦參堿的含量最低，苦參堿的含量最高；葉中槐果堿的含量明顯高于根和莖。豆科槐屬植物是提取苦參堿等系列生物堿的重要來源，其中苦參作為常用藥材被《中華人民共和國藥典》一部收載，其質(zhì)量控制以含苦參堿和氧化苦參堿的總量不得少于1.2%為標(biāo)準(zhǔn)，從白刺花的測定結(jié)果以及文獻(xiàn)資料顯示，白刺花的根、莖、葉、花和果實(shí)中均含有這一系列生物堿，其含量在有些部位達(dá)到或超過了苦參的《藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，而白刺花作為一種灌木，生物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于苦參，如果把它藥用或者作為提取苦參堿類系列生物堿的原材料，都是不錯的選擇。

從白刺花的指紋圖譜結(jié)果看，各樣品指紋圖譜中共有峰的相對保留時間基本一致，RSD均小于2%，符合指紋圖譜要求，但各共有峰的面積差異顯著，RSD為3.02%～66.95%，說明各樣品中化合物的含量差異較大。從圖譜上看，9號峰(苦參堿)、13號峰(氧化苦參堿)和14號峰代表的化合物含量高，占白刺花中總生物堿含量的一半以上。

本文建立了白刺花高效液相色譜指紋圖譜，標(biāo)定了14個共有峰，同時測定了白刺花中苦參堿、槐果堿和氧化苦參堿的含量，該方法簡單易行，重復(fù)性、專屬性、回收率均符合要求，可以用該方法來控制白刺花的質(zhì)量。